臭氧水不同作用方式對真菌殺滅效果的比較

張 丹，寧家偉，梁 睿，李 穎，馬海利

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

消毒是疫病防治的一項基礎(chǔ)性措施，選取有效的消毒劑是保障規(guī)模化養(yǎng)殖場生物安全的關(guān)鍵[1]。目前，我國大部分畜禽養(yǎng)殖企業(yè)所使用的消毒劑都或多或少存在環(huán)保、安全以及消毒不徹底等問題，因此，有必要尋找一種安全無毒的消毒劑進行替代，而臭氧作為一種高效、經(jīng)濟、廣譜、綠色的消毒物質(zhì)，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中無疑有著巨大的應(yīng)用潛力。

臭氧消毒具有廣譜性和清潔性，對病毒、細菌繁殖體、細菌芽孢、真菌、霉菌孢子等病原微生物均具有殺滅作用[2-3]，且臭氧的合成原料是空氣或者氧氣，合成后會快速分解為氧氣，消毒后不會殘留有害物質(zhì)。臭氧消毒還具有高效性，同一時間內(nèi)臭氧對病毒的殺滅效果是氯殺滅效果的幾倍[4]，與氯消毒相比，臭氧在很短的接觸時間內(nèi)可取得相同的消毒效果[5]。盡管臭氧在消毒方面的應(yīng)用被廣泛報道，但我國對臭氧消毒技術(shù)的應(yīng)用仍處于起步階段，需要對臭氧消毒的可能性和限制因素進行深入研究。

本研究以白色念珠菌作為真菌繁殖體代表、以黑曲霉孢子作為霉菌孢子代表，研究臭氧水不同作用方式對真菌的殺滅作用，旨在為臭氧水在畜禽養(yǎng)殖過程中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗指標(biāo)菌為白色念珠菌（Candida albicans）ATCC 10231、黑曲霉菌（Aspergillus niger）ATCC 16404 孢子，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物食品衛(wèi)生與檢驗檢疫實驗室保存。培養(yǎng)基為普通培養(yǎng)基和沙保羅培養(yǎng)基；中和劑為5 g/L 的硫代硫酸鈉。

1.2 試驗儀器

多功能臭氧發(fā)生器（OZU-AP-300，山西中通高技術(shù)有限責(zé)任公司）、臭氧分析儀（BMT 964，德國BMT 公司）、凱電醫(yī)用噴霧器（CD500，凱電科技有限公司）

1.3 試驗方法

1.3.1 臭氧水的制備 通過OZU-AP-300 型多功能臭氧發(fā)生器制備臭氧氣體和臭氧水，臭氧水初始pH 值在6.7±0.2，通過冰塊調(diào)節(jié)水溫在（10±2）℃。

1.3.2 臭氧水濃度測定 按照文獻[6]的碘量法對臭氧水濃度進行測量。

1.3.3 菌懸液、染菌載體的制備 按照文獻[7]的方法，以無菌生理鹽水制備白色念珠菌和黑曲霉菌孢子懸液，以濾紙片制作菌片。使用麥?zhǔn)媳葷峁鼙葘簼舛龋鶕?jù)比對結(jié)果，稀釋菌液進行活菌培養(yǎng)計數(shù)，計算菌液濃度。

1.3.4 懸液定量殺菌試驗 使用無菌生理鹽水，將菌液稀釋到1×107～5×107cfu/mL。臭氧水設(shè)4 個質(zhì)量濃度（3，5，10，15 mg/L）進行定量殺菌試驗。在檢測臭氧水濃度后，吸取5.0 mL 臭氧水加入盛有0.1 mL 菌液的試管中，混勻，分別在作用3，5，10，15 min 后吸取0.5 mL 混合溶液，加于含4.5 mL 中和劑的試管內(nèi)，混勻靜置5 min，終止反應(yīng)。倍比稀釋后，取1 mL 菌液做傾注培養(yǎng)，每管接種2 個培養(yǎng)皿，并置于適宜溫度培養(yǎng)，白色念珠菌培養(yǎng)48 h 后計數(shù)，黑曲霉孢子培養(yǎng)72 h 后計數(shù)，同時設(shè)置陽性對照組（4.5 mL 無菌生理鹽水代替臭氧水）。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，計算殺滅率，重復(fù)3 次。

1.3.5 載體浸泡定量殺菌試驗 取5 mL 臭氧水加入裝有菌片的試管中，分別作用3，5，10，15 min 取出菌片，置于含5 mL 中和劑的試管內(nèi)，漩渦混合儀振蕩20 s，將菌體洗脫。倍比稀釋后，培養(yǎng)計數(shù)，計算殺滅率，重復(fù)3 次。

1.3.6 載體噴霧殺菌試驗 根據(jù)載體浸泡定量殺菌試驗結(jié)果，選擇10，15 mg/L 的臭氧水，利用醫(yī)用電動噴霧器（水壓60 kPa，脈沖頻率1 200 次/min）進行載體噴霧殺菌試驗。每種菌所染菌片分開試驗。試驗時，每種載體菌片各取3 片，以等邊三角形排放于無菌玻璃培養(yǎng)皿中。在檢測臭氧水濃度后，將臭氧水裝入噴霧器水箱。在培養(yǎng)皿斜上方1 m 處進行噴霧，以噴霧量不使菌片流液為度。分別在3，5，10，15 min 后取出菌片，置于含有5 mL 中和劑的試管內(nèi)，漩渦混合儀振蕩20 s，將菌體洗脫。倍比稀釋后，培養(yǎng)計數(shù)，計算殺滅率，重復(fù)3 次。同時設(shè)空白對照組，用無菌生理鹽水代替臭氧水，按同樣方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 懸液定量殺菌結(jié)果分析

從表1，2 可以看出，隨著臭氧水質(zhì)量濃度的增加和時間的增加，殺滅率逐步提高。10 mg/L 臭氧水懸液作用5 min 可以完全殺滅溶液中的白色念珠菌（表1），10 mg/L 臭氧水作用3 min 能夠完全殺滅懸液中的黑曲霉孢子（表2）。

表1 懸液定量法白色念珠菌殺滅率 %

表2 懸液定量法黑曲霉孢子殺滅率 %

2.2 載體浸泡定量殺菌結(jié)果分析

由表3，4 可知，在載體浸泡定量殺菌試驗中，要達到100%的殺滅率，需要的時間和濃度都要比懸液定量殺菌試驗多。15 mg/L 臭氧水浸泡10 min 能夠完全殺滅載體上的白色念珠菌，10 mg/L 臭氧水浸泡10 min 或15 mg/L 臭氧水浸泡5 min 能夠100%殺滅載體上的黑曲霉孢子（表4）。

表3 載體浸泡定量法白色念珠菌殺滅率 %

表4 載體浸泡定量法黑曲霉菌孢子殺滅率 %

2.3 載體噴霧殺菌結(jié)果分析

用10 mg/L 或15 mg/L 臭氧水噴霧處理白色念珠菌、黑曲霉孢子菌片3，5，10，15 min，白色念珠菌滅活率均在12%以下（表5），黑曲霉孢子滅活率均在21%以下（表6），殺滅率較低，噴霧法滅菌效果不是很好。

表5 噴霧定量法白色念珠菌殺滅率 %

表6 噴霧定量法黑曲霉菌孢子殺滅率 %

3 結(jié)論與討論

本研究采用3 種方法評價臭氧水對真菌的殺滅功效，結(jié)果表明，采用懸液定量法和載體浸泡法，10 mg/L 臭氧水作用10 min 能有效殺滅溶液中及載體上的真菌繁殖體和霉菌孢子；比較同濃度臭氧水殺菌效果，殺滅懸液中的真菌時間要短于殺滅載體上的真菌；相同時間內(nèi)，達到相同效果所需臭氧水濃度懸液法低于載體浸泡法。臭氧水更易殺滅溶液中的真菌[8]，對于載體上附著的真菌則較難完全殺滅，推測可能是載體阻礙了臭氧與真菌的接觸，而使臭氧的消毒效果變差[9]。在實踐中，可對需要浸泡消毒的器具進行預(yù)先處理，除去可見污染物，并通過持續(xù)通入臭氧氣體的方式，來提高臭氧水消毒效果。

相比較而言，臭氧更適用于水體的消毒[10]。在養(yǎng)殖場中，臭氧可用于污水處理。王華然等[11]研究表明，水溫對水中臭氧濃度有非常顯著的影響，隨著水溫的升高，水中臭氧濃度快速降低，且半衰期快速縮短[12]，所以，用臭氧水浸泡消毒時，應(yīng)對水溫進行調(diào)控，以提高臭氧溶解度，增強消毒效果。魏蘭芬等[13]研究固體過氧乙酸殺菌效果，結(jié)果表明，將小牛血清作為有機干擾物，發(fā)現(xiàn)在菌液中含10%小牛血清時，臭氧水對大腸桿菌的殺滅率低于10%，有機物會與微生物競爭臭氧而使臭氧消毒效果下降。養(yǎng)殖場采用臭氧處理污水時，最好先對污水進行一定的絮凝過濾措施，并盡可能保持水溫在一定范圍之內(nèi)以達到最佳消毒效果[14]。

由臭氧水噴霧殺菌結(jié)果可知，以15 mg/L 的臭氧水進行噴霧消毒，作用15 min，對白色念珠菌、黑曲霉孢子的殺滅率均低于40%[15]，沒有達到殺菌效果。說明臭氧水噴霧法的殺菌效果較差，不能對載體上附著的真菌進行有效的殺滅[16]。這可能是由于在臭氧水噴施過程中，霧滴體積較小,比表面積變大，水中溶解的臭氧在下落過程中部分臭氧分解為氧氣，造成有效濃度的下降，達不到殺菌所需濃度[17-18]。因此，要提高臭氧水噴施的防控效率還需研究其噴灑特性。盡管臭氧水噴霧對環(huán)境的消毒效果較差，不適合用于養(yǎng)殖場環(huán)境的消毒，但是臭氧水可作為臭氧供體，在全封閉養(yǎng)殖環(huán)境中進行臭氧水噴霧，可凈化空氣、提供氧氣[19-20]，有利于畜禽的健康生長。