高效液相色譜法測定紅香酥梨中6 種有機酸含量

李彩林，楊志國，王華瑞，李美萍

（1.山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所，山西太原030031；2.山西大學生命科學學院，山西太原030006）

紅香酥梨是由中國農業科學院鄭州果樹研究所以庫爾勒香梨與鵝梨雜交選育而成的新梨品種，其果皮薄、汁多、肉脆、香甜可口，且豐產耐貯，因此，具有良好的發展前景[1-2]。果實中有機酸含量及種類是決定果實內在品質的重要因素之一[3-4]，也是水果中主要的營養物質之一，它不僅對水果的口感、色澤及生物穩定性有影響，而且可以促進人們的食欲[5]，因此，研究紅香酥梨中有機酸種類及含量對紅香酥梨的開發和利用具有重要意義。

有機酸的測定方法有氫氧化鈉滴定法[6]、離子色譜法[7]、氣相色譜法[8]和高效液相色譜法[9]等。由于高效液相色譜法具有靈敏度高、準確度好、操作簡便等優點[10-11]，因此，其被廣泛應用于棗[12]、蘋果[13]、藍莓[14]、楊梅[15]等水果中有機酸的檢測。孫延芳等[16]利用高效液相色譜法對酸棗中的有機酸和維生素C 含量進行了檢測；關秀杰等[17]利用反相高效液相色譜法對火龍果中的6 種有機酸含量進行了測定；胡志群等[18]測定了妃子笑和糯米滋2 個荔枝品種中有機酸、可溶性糖和維生素C 的含量變化；王琴飛等[19]建立了西番蓮中有機酸含量的高效液相色譜檢測方法；RODRIGO 等[20]對水果果汁中蘋果酸、酒石酸和Vc 進行了檢測；馬倩倩等[21]對南疆地區駿棗和0604 酸棗果實中主要有機酸和Vc 進行了定量分析。但目前關于紅香酥梨中有機酸含量測定尚未見文獻報道。

本試驗旨在建立一種高效、快捷測定紅香酥梨中有機酸含量的方法，以期為紅香酥梨的品質研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 試驗所用紅香酥梨采于山西省運城市鹽湖區百忍堂農場，采后立即運回山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所冷庫中（（-1.0±0.5）℃），挑選無病蟲害、無腐爛、無機械損傷的紅香酥梨作為試驗材料。

1.1.2 儀器設備與試劑 1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）配有四元泵、真空脫氣機、手動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、色譜工作站；CAPECELL PAK MG S5 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Milli-Q Academic 超純水機（美國密理博公司）；AS10200AH 型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Allegra X-30R Centrifuge 高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；SHA-C 水浴恒溫振蕩器（金壇市金城國勝實驗儀器廠）；研缽；IMS-20 全自動雪花制冰機（常熟市雪科電器有限公司）；Sartorius CP224S 電子分析天平（德國賽多利斯公司）；0.45 μm 微孔濾膜。

供試試劑為D- 蘋果酸、L- 蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸標準品（Sigma 公司）；甲醇（色譜純）；磷酸（分析純）、高純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件 CAPECELLPAKMGS5 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.1%磷酸水溶液- 甲醇，其體積比為96∶4，等度洗脫；柱溫40 ℃，流速1 mL/min；檢測波長為210 nm；進樣量20 μL。

1.2.2 有機酸標準品母液配制 分別精密稱取D-蘋果酸、L- 蘋果酸、檸檬酸、乳酸各0.25 g 以及酒石酸0.125 g、琥珀酸0.625 g 于50 mL 燒杯中，加超純水溶解后轉移至50 mL 容量瓶中定容，制成D-蘋果酸、L- 蘋果酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸的標準貯備母液。

1.2.3 混合標準溶液的配制 將1.2.2 配制好的標準貯備母液用0.1%磷酸水溶液依次稀釋成2.5，1.0，0.5，0.25，0.2，0.1，0.05，0.025，0.02，0.01，0.005 mg/mL的系列混標溶液，將系列混標溶液經0.45 μm 微孔濾膜過濾（與樣品的色譜條件相同）后注入高效液相色譜儀中進行標準曲線的繪制。

1.2.4 樣品的處理 稱取20 g 新鮮果肉，加入5 mL 0.1%的磷酸水溶液冰浴研磨成勻漿后轉入100 mL三角瓶中，用0.1%的磷酸水溶液多次沖洗研缽后將三角瓶置于35 ℃的混合振蕩器中振蕩30 min，再將其轉入50 mL 離心管中超聲波提取30 min，使有機酸充分浸出，冷卻后在4 ℃下以9 000 r/min 離心20 min，上清液過濾到50 mL 容量瓶中，用0.1%磷酸水溶液定容至刻度，待測液用0.45 μm 濾膜過濾后注入高效液相色譜儀中進行分析。

1.3 數據處理

采用Excel 軟件對數據進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

按照1.2.1 的色譜條件將不同濃度的系列混標溶液依次進樣，每個濃度重復3 次取其平均值，以峰面積（Y）對質量濃度（X，mg/mL）求標準曲線的回歸方程和相關系數，結果列于表1。

表1 6 種有機酸對照品標準曲線方程

從表1 可以看出，6 種有機酸的相關系數均達到0.999 9，表明線性關系良好，說明可以用此標準曲線來測定紅香酥梨中有機酸的含量。

2.2 有機酸標準品與紅香酥梨樣品高效液相色譜分析

取D- 蘋果酸、L- 蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸的混標溶液進樣，其色譜圖如圖1 所示。取紅香酥梨樣品提取液進樣，其色譜圖如圖2 所示。

從圖1 可以看出，6 種有機酸標準品在此色譜條件下均得到良好的分離，且峰形良好，各組分的出峰順序依次為酒石酸、L- 蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、D- 蘋果酸，其出峰時間分別為3.185，3.893，4.679，6.865，7.483，8.989 min。

由圖2 可知，紅香酥梨中含有D- 蘋果酸、L-蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸、酒石酸6 種有機酸，且各有機酸的分離度較好，其出峰時間分別是3.186，3.947，4.894，6.985，7.657，9.022 min。由此可以看出，待測樣品的出峰時間較標準品稍晚一些。

2.3 精密度檢測

按照1.2.1 的色譜條件將0.2 mg/mL 的混合標準溶液連續進樣5 次，考察該方法的精密度，根據峰面積計算酒石酸、L- 蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、D- 蘋果酸的相對標準偏差（RSD），其結果分別為1.31%，1.54%，2.64%，1.32%，0.77%，0.32%，表明該方法的精密度良好（表2）。

表2 精密度試驗結果（n＝5）

2.4 重復性檢測

按1.2.4 的方法制備同一份紅香酥梨樣品5 份，在1.2.1 的色譜條件下進行樣品分析，根據得到的峰面積計算各有機酸的重復性，得出D- 蘋果酸、L- 蘋果酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸的相對標準偏差（RSD）在0.66%～3.07% ，說明該方法的重復性達到分析的要求（表3）。

表3 重復性試驗結果（n＝5）

2.5 穩定性檢測

表4 穩定性試樣結果（n＝6）

取同一份紅香酥梨樣品貯備液，按照1.2.1 的色譜條件進行測定，分別記錄樣品在貯藏0，2，4，6，8，12 h 下各有機酸的峰面積，從而判斷其穩定性。結果顯示，酒石酸、L- 蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、D- 蘋果酸的相對標準偏差（RSD） 分別為1.44%，1.56%，3.21%，0.92%，3.93%，4.33%，說明供試樣品在12 h 內是穩定的（表4）。

2.6 回收率測定

表5 6 種有機酸的回收率（n＝6）

取6 份體積相同且已知各有機酸含量的紅香酥梨樣品提取液，分別加入相同體積不同質量濃度的有機酸對照品溶液，混合均勻后用0.45 μm 濾膜過濾，在1.2.1 的色譜條件下進行樣品回收率試驗，結果如表5 所示。結果顯示，各有機酸的回收率為96.00%～105.42%，相對標準偏差（RSD）為0.81%～4.68%，表明該方法準確度較高。

2.7 紅香酥梨樣品中有機酸含量的測定

按1.2.4 方法對紅香酥梨樣品進行處理，在1.2.1 的色譜條件下，測定紅香酥梨中各有機酸種類與含量，每個樣品重復3 次，取平均值（表6）。

表6 紅香酥梨中有機酸含量測定結果

由表6 可知，紅香酥梨中以蘋果酸與檸檬酸為主要有機酸，且蘋果酸含量最多，為1 493.32 mg/kg，占到有機酸總量的71.16%；其次為檸檬酸（304.78 mg/kg），占到有機酸總量的14.52%；紅香酥梨中次要有機酸為琥珀酸與酒石酸，其含量分別為129.35，97.85 mg/kg，分別占到總有機酸含量的6.16%和4.66%；乳酸的含量則相對較低。

3 結論

本研究在CAPECELL PAK MG S5 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），0.1%磷酸水溶液和甲醇作流動相，柱溫40 ℃，流速1 mL/min，檢測波長210 nm，進樣量20 μL 的色譜條件下能有效分離出紅香酥梨中6 種有機酸，并對其含量進行了測定，其標準曲線相關系數均在0.999 9 以上，回收率為96.00%～105.42%，精密度、重復性、穩定性的相對標準偏差（RSD）均在5%以內，表明該測定方法良好，且紅香酥梨中以蘋果酸與檸檬酸為主要有機酸，琥珀酸與酒石酸為次要有機酸，利用該方法對紅香酥梨中有機酸積累動態及風味特征的研究具有重要意義。