榆林沙區(qū)引種波爾卡樹莓的組織培養(yǎng)與快速繁殖

王建新，吳志茹，馮光惠

（1.榆林市林業(yè)工作站，陜西榆林719000；2.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林719000）

樹莓（Rubus idaeus L.）俗稱覆盆子，是薔薇科懸鉤子屬（Rubus L.）植物，為多年生落葉灌木果樹。樹莓果實(shí)營養(yǎng)價值高、口感好，果實(shí)中除含有豐富的糖類、氨基酸、纖維素外，還有糅化酸、SOD 酶、類黃酮等對人體具有保健作用的成分。樹莓的根莖葉在醫(yī)藥、化妝、保健、食品、加工等方面都有著廣泛的用途。樹莓生長快、耐瘠薄、耐干旱，是優(yōu)良的水土保持植物[1]。樹莓與沙棘、枸杞并列為北方三大水土保持先鋒植物，并逐漸向產(chǎn)業(yè)化方向發(fā)展[2-4]。近年來，樹莓的國內(nèi)外市場需求不斷增加，果實(shí)價格持續(xù)上漲，東北地區(qū)和內(nèi)蒙古等北方優(yōu)生地人為采摘果實(shí)現(xiàn)象普遍，養(yǎng)護(hù)管理措施相對滯后，野生種質(zhì)資源破壞嚴(yán)重，優(yōu)勢野生種源地不斷減少，優(yōu)質(zhì)果實(shí)產(chǎn)量相對降低[5-6]。因此，拓展和引進(jìn)樹莓優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，在適生地開展樹莓新品種的栽培和利用具有十分重要的意義。

榆林市林業(yè)站近年從東北地區(qū)引進(jìn)多個紅樹莓品種，在榆林沙區(qū)經(jīng)過5～6 a 的馴化栽培，生長勢良好，抗寒、抗旱、抗病蟲害和耐鹽堿等適應(yīng)能力均很強(qiáng)，但不同品種結(jié)果能力有差異，其中，波爾卡口感好，味道美，結(jié)果性狀好。傳統(tǒng)的繁殖方法是靠根蘗、扦插、壓條進(jìn)行，繁殖系數(shù)低，苗木質(zhì)量差，不利于規(guī)模化生產(chǎn)的需要[7-8]。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)樹莓苗木，不僅能保持母株的優(yōu)良特性，同時可提高繁殖系數(shù)和苗木質(zhì)量。

本研究以榆林沙區(qū)引種成功且結(jié)果性狀優(yōu)良的樹莓品種波爾卡為試材，以春季新梢幼嫩莖段和莖尖為外植體，通過組培方法研究不同培養(yǎng)基上外植體的生長狀況，探索樹莓的組織培養(yǎng)和快速繁殖體系，以期為榆林沙區(qū)引種樹莓的產(chǎn)業(yè)化育苗提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料是2017 年春季從東北地區(qū)引進(jìn)的2 年生樹莓新品種波爾卡，在榆林沙區(qū)經(jīng)過2 a 的引種栽培和田間試驗(yàn)，生長勢良好。2019 年4 月于引種基地采集1 年生枝條上萌發(fā)的幼嫩新梢，裝于保濕透氣塑料袋帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的滅菌 剪去幼嫩新梢上的葉片并剪成4～5 cm 長帶1～2 個芽的莖段，每次試驗(yàn)剪15～20 個莖段，用1%的吐溫-80 浸泡10～15 min，自來水下沖洗0.5～1.0 h，備用。在超凈工作臺上，將外植體材料轉(zhuǎn)入無菌燒杯中，用75%的酒精浸泡約30 s，無菌水漂洗2 次，再用0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒，消毒時間設(shè)置為4，6，8，10，12 min，每隔2 min 用玻璃棒攪拌1 次，使漂浮在液面上方的材料能夠充分接觸消毒液，無菌水漂洗5 次，分裝于無菌培養(yǎng)瓶。每瓶接種1 個外植體，不同消毒時間均接種40 瓶，統(tǒng)計不同消毒時間的污染率和對外植體的傷害程度。

1.2.2 外植體的接種與培養(yǎng)

1.2.2.1 初代誘導(dǎo)培養(yǎng) 用無菌濾紙吸取外植體上的多余水分，將外植體切成大約1 cm 長帶1 個腋芽或頂芽的莖段，接種在以MS 為基本培養(yǎng)基附加不同質(zhì)量濃度激素配比（6-BA 分別為0.5，1.0，1.5，2.0 mg/L，NAA 分別為0.05，0.10，0.20 mg/L）的12 種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種40 個腋芽和10 個頂芽。為降低污染率，每瓶接種2 個外植體。暗培養(yǎng)7 d 后轉(zhuǎn)為25 ℃光照培養(yǎng)16 h。研究不同培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響，30 d 后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率以及側(cè)芽和頂芽的萌發(fā)率。

1.2.2.2 繼代增殖培養(yǎng) 取已萌發(fā)1～2 cm 的單芽或切割叢生芽為單芽，接種在含不同質(zhì)量濃度激素配比（6-BA 分別為1.0，1.5，2.0 mg/L，NAA 分別為0.01，0.02，0.05 mg/L）的9 種增殖培養(yǎng)基上，每瓶接種2 個單芽，每種培養(yǎng)基接種10 瓶。25 ℃光照培養(yǎng)16 h，觀察記錄生長情況，統(tǒng)計不同培養(yǎng)基對單芽增殖的影響，30 d 后計算平均增殖系數(shù)。

1.2.2.3 生根培養(yǎng) 取3～4 cm 長的單株苗，分別接種于MS、1/2 MS、1/3 MS 添加不同質(zhì)量濃度IBA（0.1，0.2，0.5 mg/L）的9 種生根培養(yǎng)基中，每瓶接種2 個單株苗，每種培養(yǎng)基接種20 瓶。研究不同培養(yǎng)基對樹莓組培苗生根的影響，30 d 后統(tǒng)計生根率及根系生長狀況。

1.2.3 組培苗的馴化移栽 組培苗的馴化移栽是植物組培快繁的重要環(huán)節(jié)，需要從無菌向有菌、高溫向變溫、高濕向低濕、弱光向強(qiáng)光等環(huán)境因素轉(zhuǎn)變。選用冀菲等[9]研究黑果枸杞組培苗馴化移栽的基質(zhì)，前期7 d 的煉苗階段與培養(yǎng)室環(huán)境相似，遮陰降低光照強(qiáng)度，噴灑自來水保濕且降低溫度，相對濕度為85%～90%；后期馴化階段與室外環(huán)境相近，逐漸增加自然光照。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時間對外植體污染率的影響

由表1 可知，先用75%的酒精對外植體消毒30 s，再用0.1%的HgCl2溶液消毒8 min 效果最好，污染率為7.5%，外植體顏色未發(fā)生變化；滅菌10 min的污染率仍為7.5%，但外植體顏色較消毒8 min變深，有褐變現(xiàn)象，受傷害程度較大；滅菌12 min的污染率為0，受傷害程度嚴(yán)重，嚴(yán)重影響外植體活性，會導(dǎo)致愈傷組織誘導(dǎo)率和成苗率降低。

表1 滅菌時間對外植體污染率的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)率及芽萌發(fā)的影響

外植體接種到培養(yǎng)基上，對于不易形成不定根的植物，需通過誘導(dǎo)的愈傷組織吸收養(yǎng)分和水分。以MS 為基本培養(yǎng)基，將無菌外植體莖段和莖尖接種于添加不同濃度激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)7 d 后，在外植體切口處出現(xiàn)白色的愈傷組織，呈松散的不規(guī)則瘤狀；轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)，愈傷組織顏色由白逐漸變綠，膨大突起，逐漸增殖變大變松散。30 d 后在愈傷組織表面觀察到綠色的不定芽，同時莖段側(cè)芽和頂芽萌發(fā)變長。從表2 可以看出，不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響差異較大，在細(xì)胞分裂素6-BA 濃度一定時，隨著生長素NAA 濃度的升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率相應(yīng)升高，其中，在4 種6-BA 濃度中，當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 時，相應(yīng)誘導(dǎo)率均最高；在生長素NAA 濃度一定的情況下，隨著6-BA 濃度的升高，愈傷組織誘導(dǎo)率變化不大，其中，當(dāng)NAA 質(zhì)量濃度為0.2 mg/L 時，相應(yīng)誘導(dǎo)率均最高。在愈傷組織形成不定芽的同時，頂芽和側(cè)芽均能夠萌發(fā)，但二者的萌發(fā)率不同，統(tǒng)計12 種培養(yǎng)基中所有側(cè)芽（480 個）和頂芽（120 個）外植體的萌發(fā)情況發(fā)現(xiàn)，側(cè)芽的萌發(fā)率為80%，且在不同培養(yǎng)基中的生長勢差異較大；頂芽的萌發(fā)率為100%，且生長健壯，整齊一致。因此，最適合樹莓外植體愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基是MS＋6-BA1.0 mg/L＋NAA 0.20 mg/L，誘導(dǎo)率為96%，選取頂芽為外植體更合適。

表2 不同培養(yǎng)基對樹莓外植體愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對芽增殖的影響

取1～2 cm 生長健壯攜帶少量愈傷組織的單株苗，接種在含不同濃度激素配比的增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d 后，單株苗基部愈傷組織開始變大變綠，之后逐漸增大并再次分化出叢生不定芽，30 d 后統(tǒng)計平均增殖系數(shù)發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化叢生芽的能力不同，平均增殖系數(shù)不同，叢生芽的生長勢差異較大。在6-BA 濃度一定時，隨著生長素NAA濃度的升高，不定芽總數(shù)相應(yīng)升高，但是，在3 種6-BA 濃度中，當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度為1.5 mg/L 時，相應(yīng)不定芽總數(shù)均最高；在生長素NAA 濃度一定時，當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度為1.5 mg/L 時，不定芽誘導(dǎo)率均最高。所以，最適樹莓不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L，平均增殖系數(shù)為9.70，玻璃化現(xiàn)象較輕，叢生芽生長健壯（表3）。

表3 不同培養(yǎng)基對不定芽增殖的影響

2.4 不同培養(yǎng)基對組培苗生根的影響

表4 不同培養(yǎng)基對組培苗生根的影響

取3～4 cm的健壯單株，分別接種于MS、1/2 MS、1/3 MS 添加不同濃度IBA 的生根培養(yǎng)基中，7 d 后組培苗基部愈傷組織膨大并生長出白色根尖，14 d后根生長速度加快，在主根上萌發(fā)出側(cè)根。30 d 后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基及IBA 濃度對樹莓組培苗生根的影響不同，生根速度及生根率差異明顯，在基本培養(yǎng)基一定時，隨著IBA 濃度的升高，生根率均相應(yīng)升高，其中，1/2 MS 基本培養(yǎng)基的生根率均最高；在IBA 濃度一定時，1/2 MS 基本培養(yǎng)基的生根率也是最高的，且根系生長均正常。所以，最適組培苗的生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋I(xiàn)BA 0.5 mg/L，生根率達(dá)97.5%，且主根比較健壯，側(cè)根數(shù)量多，植株生長旺盛（表4）。

2.5 組培苗的馴化移栽

生根培養(yǎng)30 d，選擇根系生長健壯、發(fā)育良好的組培苗，洗掉根部培養(yǎng)基，剪掉過多須根，僅留主根和部分側(cè)根，將幼苗移入熏蒸消毒基質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)泥炭土、蛭石、珍珠巖（體積比為2∶1∶1）營養(yǎng)基質(zhì)更適合組培苗的生長。經(jīng)過統(tǒng)計，移栽50 株，成活44 株，成活率高達(dá)88%，植株生長健壯，與野生紅樹莓的外部形態(tài)特征相似度高。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，榆林沙區(qū)引種波爾卡樹莓的外植體最佳采集時間為4 月下旬，生長活性強(qiáng)，褐變現(xiàn)象較輕；最適外植體材料為新梢頂芽，不僅易誘導(dǎo)形成愈傷組織，而且萌發(fā)率高；用HgCl2消毒最佳時間為8 min，最適樹莓愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.20 mg/L，最適樹莓不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L，平均增殖系數(shù)為9.7，最適組培苗的生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋I(xiàn)BA 0.5 mg/L，生根率達(dá)97.5%，且生長勢良好，植株健壯。本研究體系能在較短時間內(nèi)獲得數(shù)量多且遺傳性狀穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)樹莓組培苗，對推動榆林沙區(qū)樹莓產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。

在植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)過程中，出現(xiàn)污染是普遍現(xiàn)象，其中，外植體接種污染是主要原因，導(dǎo)致試驗(yàn)無法達(dá)到預(yù)期效果。用0.1%HgCl2溶液滅菌效果要好于10%的NaClO 溶液，但前者一旦污染對人傷害較大，操作要特別小心細(xì)致。消毒時間適宜控制在8 min 左右，易雙雙等[10]、林樹燕等[11]有相似報道。在外植體消毒、接種過程中，要嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)規(guī)程操作，接種過程中要隨時用75%酒精擦拭雙手和臺面，以減少污染的發(fā)生。

在木本植物的組培過程中，易出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。褐變是由于植物組織中酚類物質(zhì)被多酚氧化酶（PPO）氧化后產(chǎn)生醌類物質(zhì)，逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中并累積起來，抑制細(xì)胞中其他酶的活性，毒害培養(yǎng)的外植體材料。在接種前預(yù)冷外植體、初代培養(yǎng)前期暗培養(yǎng)、縮短轉(zhuǎn)瓶周期均可抑制褐化現(xiàn)象，李小艷等[12]在黑枸杞組織培養(yǎng)中得出類似的研究結(jié)果。外植體取材時間也是影響褐化的重要因素，在榆林沙區(qū)最適外植體取材時間是4 月下旬，可能是由于該時期幼嫩莖段部位酚類化合物含量低或多酚氧化酶活性低的原因。

在樹莓初代誘導(dǎo)培養(yǎng)中，多數(shù)學(xué)者以帶芽莖段和莖尖為外植體，MS 為基本培養(yǎng)基，并附加不同濃度配比的細(xì)胞分裂素和生長素。二者的濃度及比值決定細(xì)胞分化的方向，由于所用激素藥品的效用不盡相同，采用的激素梯度和配比設(shè)計方法不同，導(dǎo)致最終得出的最適培養(yǎng)基配方有一定差異。本研究與畢海林等[13]研究的秋福樹莓組織培養(yǎng)相比，所用6-BA 濃度偏小，NAA 濃度相同；與孟靜靜等[14]研究的黑樹莓組培相比，6-BA 和NAA 濃度均偏大，但比值相近，原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

在樹莓不定芽的繼代增殖培養(yǎng)中，因選取的不定芽大小不同、不定芽是否攜帶愈傷組織以及統(tǒng)計的不定芽大小與時間不同而導(dǎo)致得出的增殖系數(shù)均有所差異。本研究選取1～2 cm 帶部分愈傷組織的不定芽，得出最適增殖培養(yǎng)基的6-BA、NAA 質(zhì)量濃度與國內(nèi)學(xué)者[15-17]的研究結(jié)果基本一致，即6-BA質(zhì)量濃度為0.5～2.0 mg/L、NAA 質(zhì)量濃度多為0.05～0.20 mg/L。在統(tǒng)計不定芽的增殖系數(shù)時，衡量芽大小的指標(biāo)不確定，增殖系數(shù)有差異。同一培養(yǎng)基，相同長度的芽，生長過程中的增殖程度也不同，可能是由內(nèi)部生理生化代謝及培養(yǎng)環(huán)境的細(xì)微差異導(dǎo)致。另外，培養(yǎng)溫度、光照時間等環(huán)境因素也是影響增殖系數(shù)的因素，仍需進(jìn)一步深入細(xì)致地研究。

生根是木本植物獲得健壯組培苗的關(guān)鍵，合適的生長素及濃度是誘導(dǎo)生根的重點(diǎn)。在木本植物組培苗的生根試驗(yàn)中，多數(shù)學(xué)者選用的生長素是NAA與IBA，有二者混合使用[18-19]，也有NAA[20]或IBA[21]單獨(dú)使用。本試驗(yàn)通過對比得出，單獨(dú)使用IBA 生根率高，添加NAA 不能有效提高生根率，可能是由于樹莓組培苗在增殖培養(yǎng)過程中自身體內(nèi)合成了較多NAA 的緣故。

馴化移栽是植物組培苗發(fā)生質(zhì)的改變的一個階段，需要從無菌向有菌過渡，溫度、濕度、光照等因子都會發(fā)生變化。關(guān)于樹莓馴化移栽的文獻(xiàn)報道較少，冀菲等[9]研究了黑果枸杞組培苗馴化移栽的基質(zhì)，移栽成活率高；而本研究采用與黑果枸杞相同的基質(zhì)配方，移栽成活率略低，也低于不同基質(zhì)配方的樹莓移栽成活率[22]，可能與樹莓不同品種特性及環(huán)境的微控有關(guān)，仍需深入研究波爾卡樹莓品種的生理生化特性，優(yōu)化馴化移栽的關(guān)鍵環(huán)境因子，不斷提高移栽成活率，從而能為波爾卡樹莓組培苗的工廠化移栽提供技術(shù)保障。