高活性抗菌、抗逆芽孢桿菌的篩選及其紫外誘變育種

姚 峻 張文舉 劉孟健 鄭新霞 盧奇成

（石河子大學動物科技學院，新疆石河子832000）

近年來由于使用抗生素等藥物性飼料添加劑的弊端日益凸顯，人們將目光投向了無毒、無殘留及無抗藥性的益生菌制劑的研究與利用。目前，益生菌作為綠色飼料添加劑已被廣泛使用，菌種主要有乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌[1]。其中，芽孢桿菌是一類能在逆境下形成休眠體芽孢以抵抗不良環境的革蘭氏陽性桿菌[2]。芽孢桿菌具有抗逆性強、營養要求簡單等優點，同時在應用的安全性、廣譜抗菌活性、穩定性及分子加工易操作性等方面具有獨特的應用優勢[3-5]。本試驗主要根據益生菌的生物學特性，以7株芽孢桿菌為研究對象，通過抑制大腸桿菌能力為主要評價指標，輔以產酶特性及對人工胃液、人工腸液的耐受性進行綜合評價，篩選出效果最優的芽孢桿菌，并進一步通過紫外誘變的方法提高其抑制大腸桿菌的能力[6-8]，以期獲得生產性能更佳的菌株，為芽孢桿菌的新型飼料微生態制劑產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種：大腸桿菌K99由石河子大學動物科技學院提供。枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、側孢芽孢桿菌由中糧（昌吉）糧油工業有限公司研發中心饋贈。

1.2 主要儀器與設備

立式高壓蒸汽滅菌器、超凈工作臺、pH 計、菌落計數儀、高速離心機、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計、磁力攪拌器、分析天平。

1.3 培養基

LB 培養基（g/l）：NaCl 10，酵母粉5，蛋白胨10，pH值7.0～7.2。

發酵培養基（g/l）：豆粕20、玉米粉30、葡萄糖5、蛋白胨2、NaCl 2、KH2PO41.5、K2HPO41.5、（NH4）2SO40.3、CaCl20.3、MnSO40.1、吐溫-80 0.3、MgSO40.6，pH值8.0。

1.4 試驗方法

1.4.1 芽孢桿菌發酵液的制備

將7株芽孢桿菌的菌種分別接種到液體LB 培養基中進化活化，調整搖床溫度至37 ℃，180 r/min搖床培養24 h，活化后的芽孢桿菌按3%（V/V）接種入發酵培養基內，在37 ℃，180 r/min 條件下搖床培養24 h后，取培養液10 ml，4 000 r/min 離心15 min，將上清液用0.2 μm無菌濾膜過濾得到無菌體發酵液。

1.4.2 體外抑菌試驗

芽孢桿菌對大腸桿菌K99體外抑菌定性實驗（抑菌圈試驗）：往已冷卻至50 ℃左右的300 ml 的LB 瓊脂培養基中加入活化后的5 ml大腸桿菌菌液，迅速混勻，然后傾注無菌平板，水平靜置待凝固后備用，每個處理分別重復3 次。將固體LB 平板分為均勻的8 塊區域，用1 ml 槍頭在試驗平板上打8 個孔，孔直徑約10 mm。用鑷子小心挑去培養基小塊以做成圓孔，往孔中注入7株芽孢桿菌的200 μl無菌體發酵液（對照組加等量滅菌發酵培養基），放置37 ℃培養24 h。如果芽孢桿菌的無菌體發酵液對大腸桿菌有抑制作用，將在接種發酵液周圍出現無大腸桿菌生長的現象，出現明顯的抑菌圈，統計抑菌圈的直徑[9]。

芽孢桿菌對大腸桿菌K99體外抑菌定量實驗：往已冷卻至50 ℃左右的300 ml 的LB 瓊脂培養基中加入活化后的5 ml大腸桿菌菌液及30 ml的無菌體發酵液（對照組加等量的滅菌發酵培養基），迅速混勻，37 ℃靜置培養24 h，在菌落計數儀上計數，每個處理分別重復3次。

抑制率(%)=（芽孢組菌落數-對照組菌落數）/對照組菌落數×100

1.4.3 粗酶液的制備

7 株芽孢桿菌的菌種分別接種到液體LB 培養基中進化活化，調整搖床溫度至37 ℃，180 r/min搖床培養24 h，活化后的芽孢桿菌按3%（v/v）接種入發酵培養基內，調整搖床溫度至37 ℃，180 r/min 搖床培養48 h 后，取培養液5 000 r/min，4 ℃離心20 min，離心取上清液，再用pH 值6.7 磷酸緩沖液稀釋適當倍數，6 500 r/min，4 ℃離心5 min，吸取上清液待測酶活。

1.4.4 蛋白酶活力的測定

參照國標GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中附錄B《蛋白酶活力的測定福林法》[10]。

1.4.5 淀粉酶活力、脂肪酶的測定

按照淀粉酶、脂肪酶檢測試劑盒（購自南京建成生物工程研究所，中國）的使用說明檢測。

1.4.6 纖維素酶活力的測定

參照NY/T 912—2004《纖維素酶制劑》中CMCNa DNS法纖維素酶活的檢測方法[11]。

1.4.7 耐人工胃液能力測定

從7株芽孢桿菌的LB斜面，接種一環于裝有50 ml的LB培養液的250 ml三角瓶中，于pH=3的人工胃液中，搖勻后，放入37 ℃的恒溫培養箱中，于120 min后取出相應試管，搖勻后10倍梯度稀釋，從適當梯度的稀釋液中，吸20 μl 涂板于培養基，放置15 min，于37 ℃培養箱中培養24 h。用菌落計數儀進行計數。

1.4.8 耐人工腸液能力測定

從7株芽孢桿菌的LB斜面，接種一環于裝有50 ml的LB培養液的250 ml三角瓶中，于37 ℃下180 r/min培養24 h。取各個菌株培養液各3 ml，加入到pH=6.8的人工腸液中，搖勻后，放入37 ℃的恒溫培養箱中，于120 min 后取出相應試管，搖勻后10 倍梯度稀釋，從適當梯度的稀釋液中，吸20 μl涂板于培養基，放置15 min，于37 ℃培養箱中培養24 h。用菌落計數儀進行計數。

1.4.9 紫外誘變育種

取培養24 h的出發菌株斜面，用接種環調取1環置于含有100 ml無菌生理鹽水的三角瓶中，180 r/min振蕩30 min，將其稀釋至1×108個/ml，備用。先打開超凈工作臺中20 W紫外燈預照30 min，以穩定光線；取0.1 ml 菌懸液均勻涂布于LB 營養瓊脂平板上；然后取各組平板依次放在紫外燈垂直下方20 cm 處進行紫外線誘變，照射時間為0、20、40、60、80、100、120、140 s。取紫外誘變后的菌液用無菌生理鹽水以10倍稀釋法進行梯度稀釋，并取三個連續梯度10-3、10-4、10-5的菌液各0.1 ml涂布于LB瓊脂培養基，將涂布好的培養基用滅菌后的牛皮紙包好并裝在黑色塑料袋中，避免光照，置37 ℃條件下培養24 h。以未經照射的菌液涂布的平板為對照，測定細胞的致死率。選擇致死率在70%～80%左右的照射時間作為誘變處理時間。以最佳誘變處理時間對巨大芽孢桿菌進行紫外誘變后，取稀釋后的菌液0.1 ml 涂布于LB 瓊脂培養基，將涂布好的LB 營養瓊脂培養基用滅菌后的牛皮紙包好并裝在黑色塑料袋中，避免光照，置37 ℃培養箱中培養24 h。待菌落長出后，將所有平板上所有菌株轉接到LB 斜面培養基，置37 ℃培養箱中培養24 h。從培養后的斜面上取菌苔一環接入LB液體培養基中，活化兩代。將活化后的菌株接種到發酵培養基管（20 ml/管），接種量為3%（V/V）。將發酵試管置于37 ℃搖床中180 r/min 培養24 h。發酵結束后，離心過濾后獲取無菌體體發酵液，再進行大腸桿菌K99體外抑菌定量實驗，獲得對大腸桿菌K99抑制率最高的誘變菌株。

由于經過紫外線誘變的菌株會在自身的修復作用下產生回復突變，所以為保證篩選的突變菌株有很好的穩定性，要進行傳代實驗以檢驗其性能。將篩選出的突變菌株連續培養5代進行抑菌試驗，測定對大腸桿菌K99的抑菌率，評價突變菌株的遺傳性狀穩定性。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌體外抑菌試驗結果

芽孢桿菌對大腸桿菌K99 抑菌試驗結果如圖1所示。7株芽孢桿菌的發酵液對大腸菌K99的抑菌圈直徑的大小依次排序為：巨大芽孢桿菌＞側孢芽孢桿菌＞枯草芽孢桿菌＞地衣芽孢桿菌＞納豆芽孢桿菌＞凝結芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌，其中巨大芽孢桿菌抑菌圈直徑最大，達到17.68 mm，側孢芽孢桿菌次之，達到17.02 mm，而凝結芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌組并未出現明顯的抑菌圈，可能是由于這2株菌產生的抗菌物質過少或者產生的抗菌物質對大腸桿菌K99 無顯著抑制作用，導致未產生明顯的抑菌圈。

圖1 芽孢桿菌發酵液抑菌試驗效果

表1結果顯示：芽孢桿菌對大腸桿菌K99的抑菌圈直徑與抑菌率成正比，說明抑菌圈法與抑菌率檢測法都能較準確的反應芽孢桿菌的抑菌性能，并且2種檢測方法相關性較強。

2.2 芽孢桿菌產蛋白酶試驗結果

芽孢桿菌產蛋白酶的能力如表2所示。7株芽孢桿菌均能產生一定的蛋白酶，但產生的蛋白酶的種類和數量有所不同，總蛋白酶活力從大到小依次為：枯草芽孢桿菌＞巨大芽孢桿菌＞地衣芽孢桿菌＞凝結芽孢桿菌＞蠟樣芽孢桿菌＞側孢芽孢桿菌，總酶活力最高的為枯草芽孢桿菌，達到305.99 U/ml，其次為巨大芽孢桿菌，達到278.76 U/ml，總蛋白酶活力較低的是納豆芽孢桿菌、側孢芽孢桿菌。有趣的是，巨大芽孢桿菌并不產生堿性蛋白酶，但卻能產生大量的酸性蛋白酶、中性蛋白酶，使得其總酶活力較高。

表1 芽孢桿菌發酵液的抑菌圈直徑統計

表2 芽孢桿菌的產蛋白酶能力統計(U/ml)

2.3 芽孢桿菌產淀粉酶、產脂肪酶、產纖維素酶試驗結果

芽孢桿菌產淀粉酶、產脂肪酶、纖維素酶的能力如表3 所示。7 株芽孢桿菌的淀粉酶活力從大到小依次為：巨大芽孢桿菌＞枯草芽孢桿菌＞蠟樣芽孢桿菌＞凝結芽孢桿菌＞側孢芽孢桿菌＞地衣芽孢桿菌＞納豆芽孢桿菌，淀粉酶活力最高的為巨大芽孢桿菌，達到45.28 U/ml，其次為枯草芽孢桿菌，達到42.96 U/ml，淀粉酶活力較低的是地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌。

表3 芽孢桿菌的產淀粉酶、產脂肪酶、產纖維素酶能力統計(U/ml)

芽孢桿菌的脂肪酶活力從大到小依次為：地衣芽孢桿菌＞枯草芽孢桿菌＞納豆芽孢桿菌＞凝結芽孢桿菌＞巨大芽孢桿菌＞側孢芽孢桿菌＞蠟樣芽孢桿菌，脂肪酶活力最高的為地衣芽孢桿菌，達到28.36 U/ml，其次為枯草芽孢桿菌，達到22.79 U/ml，脂肪酶活力較低的是蠟樣芽孢桿菌，其幾乎不產脂肪酶。

芽孢桿菌的纖維素酶活力從大到小依次為：枯草芽孢桿菌＞地衣芽孢桿菌＞巨大芽孢桿菌＞蠟樣芽孢桿菌＞側孢芽孢桿菌＞納豆芽孢桿菌＞凝結芽孢桿菌，纖維素酶活力最高的為枯草芽孢桿菌，達到22.72 U/ml，其次為地衣芽孢桿菌，達到18.41 U/ml，纖維素活力較低的是納豆芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌。

2.4 芽孢桿菌對人工胃液的耐受性

芽孢桿菌的人工胃液耐受能力如圖2 所示。地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌在pH=3的人工胃液中不但不致死，還能夠繁殖，說明這幾株芽孢桿菌具有極強的耐酸能力；納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的耐酸性也比較強，達到了90%以上；耐酸性最弱的為側孢芽孢桿菌，存活率為85.26%。

圖2 芽孢桿菌對人工胃液的耐受能力統計

2.5 芽孢桿菌對人工腸液的耐受性

芽孢桿菌的人工腸液耐受能力如圖3 所示。巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌在pH=6.9 的人工腸液中存活率達到90%以上。蠟樣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的人工腸液中存活率達到80%以上。人工腸液耐受性最差的是側孢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，兩者的存活率不足70%。

圖3 芽孢桿菌對人工腸液的耐受能力統計

根據檢測結果綜合分析，在本次研究的7 株菌中，巨大芽孢桿菌表現出最強的抑制大腸桿菌能力與較強的產酶特性及人工胃液、人工腸液的耐受性，其作為新型飼料微生態制劑的開發潛力較大，所以最終選擇巨大芽孢桿菌作為紫外誘變育種的研究對象，對其主要評價指標抑制大腸桿菌的能力進行優化。

2.6 紫外誘變結果

2.6.1 紫外照射時間對巨大芽孢桿菌致死率的影響

圖4 紫外照射時間與巨大芽孢桿菌致死率曲線

由圖4 可知，當紫外照射時間為80 s 時，巨大芽孢桿菌的致死率為78.15%，由于菌體致死率在70%至80%之間可能獲得較高的正向突變率。所以，選擇照射時間80 s為最佳誘變時間。

2.6.2 紫外誘變后菌株的篩選

由表4可知，巨大芽孢桿菌紫外誘變后獲得的28株菌中有2 株菌的抑菌率高于原始菌株，正突變率為7.14%。這兩株菌分別是UV-9和UV-26。菌株UV-9的抑菌率為88.39%，比原始菌株巨大芽孢桿菌的抑菌率提高了3.63個百分點，菌株UV-26的抑菌率為90.92%，比原始巨大芽孢桿菌的抑菌率提高了6.16個百分點。

表4 紫外誘變后各菌株的抑菌率

2.6.3 穩定性試驗

由表5 可知，傳代5 次后UV-26 菌株抑制大腸桿菌K99的能力基本保持穩定，同時UV-26菌株除了產纖維素酶能力比出發菌株略有降低外，其產蛋白酶能力、產淀粉酶能力、產脂肪酶能力、耐人工胃液、耐人工腸液的能力相比出發菌株都略有提高，且基本保持穩定。由此可見，紫外誘變后突變菌株UV-26獲得的優良性狀基本可穩定遺傳。

表5 菌株UV-26的傳代穩定性試驗結果

3 討論

本研究結果表明，7 種芽孢桿菌各自具有不同的生物學特性：巨大芽孢桿菌、側孢芽孢桿菌具有較強的抑制大腸桿菌的能力，蛋白酶總活力最高的是枯草芽孢桿菌，淀粉酶活力最高的是巨大芽孢桿菌，脂肪酶活力最高的是地衣芽孢桿菌，纖維素酶活力最高的是枯草芽孢桿菌，耐人工胃酸能力最強的是地衣芽孢桿菌，耐人工腸液能力最強的是凝結芽孢桿菌。因此要根據芽孢桿菌的不同特性，在生產應用上各有側重。在應用芽孢桿菌制劑時，可以根據實際生產中的不同要求，選育具有不同優良特性的芽孢桿菌菌株，如強抑制病原菌芽孢桿菌株、高產蛋白酶菌株、高產淀粉酶菌株、高產脂肪酶菌株、高產纖維素酶菌株、耐人工胃酸菌株及耐人工腸液菌株等。通過本次研究綜合分析，巨大芽孢桿菌在7 株菌中，抑制大腸桿菌能力最強，產酶特性及耐人工胃液、腸液的能力也較強，具有作為新型飼料微生態制劑產品的開發潛力。今后，除了繼續在高產菌株篩選、誘變育種方面深入研究外，還應利用基因工程技術，有針對性的對芽孢桿菌的抗菌基因進行克隆，使巨大芽孢桿菌菌株抑制病原菌的能力得到最大幅度的突破和提高。

4 結論

①巨大芽孢桿菌在7株菌中，抑制大腸桿菌K99的能力最強，產酶特性及耐人工胃液、腸液的能力也較強，綜合評定生物學特性最優。

②進一步對此株巨大芽孢桿菌進行紫外線誘變處理，在處理時間為80 s時篩選得到1株抑制大腸桿菌效果最好的菌株UV-26，其抑菌率可達90.92%，比出發菌的抑菌率提高了6.16 個百分點，經傳代、發酵試驗證明其遺傳性狀穩定，適合用于新型微生態制劑產品的研發。