和厚樸酚通過抑制cyclin D1 影響Hep3B 細胞增殖和周期

黃赟 李智文 黃晅昱 劉晨

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是具有高侵襲性的惡性腫瘤之一，術后生存率低，復發率高，5年生存率小于20%[1-2]。目前，手術切除、放療和化療仍是治療肝癌的主要方法。然而在過去的十余年中， HCC患者的生存率仍未見有效提高。因此，開發新的治療肝HCC的有效藥物具有十分重要的意義。和厚樸酚（honokiol，HNK）是厚樸的主要活性成分之一，具有多種藥理作用，如抗病毒、抗菌、抗炎、抗衰老、抗氧化、免疫調節和神經保護等作用[3-5]。越來越多研究表明，HNK具有廣泛的抗腫瘤活性作用[6-8]。然而，關于HNK對HCC的抗腫瘤作用，尤其是涉及體內實驗方面的研究還很少。在本研究中，我們通過研究HNK對正常肝細胞和肝癌細胞間毒性的差異，以及探討HNK對人肝癌細胞株Hep3B在體外和體內的增殖影響，從而明確HNK是否有抗肝細胞癌的作用。進一步的機制研究中，我們試圖尋找合適的分子機制來解釋上述功能變化。本研究探索了HNK在HCC治療中可能的作用機制，為HNK進一步應用于肝癌的臨床治療提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

抗細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、p53、p27、p21抗體均購自美國CellSignaling Technology公司。抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自美國Proteintech公司。細胞周期檢測試劑盒（流式）購自北京碧云天生物技術公司。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）試劑盒和二甲基亞砜購自美國Sigma公司。草酸銨結晶紫染色液購自北京索萊寶公司。

1.2 細胞培養

永生化人肝細胞LO2和人肝癌Hep3B細胞購自中國科學院上海細胞庫。細胞常規培養在37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中。當細胞生長至70%左右密度時先更換為無血清培養基，再給予藥物處理。

1.3 實驗動物及動物模型建立

4 ～ 5周齡的雌性裸鼠（BALB/C-nu/nu；18 ～ 20 g）由上海實驗動物中心提供，均飼養在福建醫科大學動物實驗中心SPF級動物房，實驗方案經福建醫科大學動物實驗倫理委員會批準。Hep3B細胞裸鼠皮下移植瘤模型建立方法如下：將Hep3B細胞調整密度為2.0×106重懸于100 mL無血清DMEM中并接種在裸鼠的左下腹來構建皮下腫瘤模型。注射10天后可觀察到腫瘤時，將裸鼠隨機分為2組，每組5只，治療組每日腹腔注射50 mg/kg 和厚樸酚，對照組為相同體積的溶劑腹腔注射，持續3周。3周后處死并收集腫瘤，并在固定前測量腫瘤重量和體積。腫瘤體積計算方法：測量長徑a（cm）和短徑b（cm），腫瘤體積V （cm3）=a×b2/2。

1.4 細胞存活率及增殖能力檢測

采用MTT法測試Hep3B細胞的存活率和增殖情況。將細胞以特定密度（1 500個細胞/孔用于測定增殖活力；5 000個細胞/孔用于測定存活率）植入96孔板中并培養1 ～ 2天。在HNK刺激后，在每個孔中加入20 μL MTT（5 mg / mL）。孵育4小時后，除去含有MTT的培養基，并向每個孔中加入150 μL 二甲基亞砜。在490 nm波長下測量每個孔的光密度值（OD）。每個實驗使用10個復孔。

1.5 平板克隆形成實驗

細胞以200個/孔的密度種植于6孔培養板上。培養14天后，用PBS洗滌細胞兩次，并用2.0%結晶紫（購自中國北京Solarbio公司）染色。使用顯微鏡對細胞克隆團進行計數，并確保每個細胞團均含有50個以上細胞。

1.6 流式細胞術分析細胞周期

使用細胞周期檢測試劑盒進行細胞周期分析。收集培養的細胞，消化后固定于70%冰冷乙醇中，并在4℃下儲存過夜。之后通過離心（1 000×g，5分鐘）除去乙醇，然后用熒光染料碘化丙啶（PI）和RNase A在37℃、避光條件下染色30分鐘。最后使用流式細胞術分析細胞周期。

1.7 Western blot法檢測蛋白水平

4℃條件下在細胞中加入蛋白裂解液，30分鐘后收集細胞裂解液，超聲碎裂細胞，離心（12 000×g，4℃，15分鐘）后測定蛋白濃度，剩余樣品混合上樣緩沖液并置于100℃中變性5分鐘。配置10% 的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，分離蛋白后轉移PVDF膜上，用相應一抗進行孵育（GAPDH稀釋濃度為1:2 000，其余抗體均為1:1 000），TBST洗滌后用相應二抗孵育，化學發光法進行顯影并進行灰度測定及統計。

1.8 統計學處理

采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析，所有數據均采用（表示。計量資料比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HNK對Hep3B及LO2細胞活力的影響

我們將兩種細胞置于不同濃度HNK或不同刺激時間下進行培養，并使用MTT測定法觀察兩種細胞存活率。結果顯示，HNK對Hep3B細胞具有顯著的細胞毒性，且有明顯的時間-濃度依賴性，50%抑制濃度（IC50）為（22.9±3.4）μM（見圖1）。然而，在相同濃度或者時間的HNK刺激下，永生化人肝細胞LO2的存活率沒有受到顯著影響（IC50＞40 μM）。該結果表明HNK對HCC細胞具有一定的細胞毒作用。

2.2 HNK在體外實驗中對Hep3B細胞增殖能力的影響

MTT實驗（見圖2A）顯示隨著HNK刺激濃度的增加，Hep3B細胞增殖曲線逐漸趨于平緩，表明HNK降低了Hep3B細胞的增殖速度具有濃度依賴性。平板克隆形成實驗（見圖2B）結果顯示隨著HNK刺激濃度的增加，細胞聚落形成數量成顯著下降（0 μM：（54.0±6.8）個；20 μM：（18.0±2.4）個；30 μM ：（5.0±1.7）個；0 μM：20 μM，P=0.016；0 μM：30 μM， P=0.009；20 μM：30 μM，P=0.034）。

2.3 HNK對Hep3B細胞周期的影響

與對照組相比，HNK治療組（30 μM，24 h）中處于G1期細胞數目升高[（51.4±2.21）% vs.（62.2±3.74）%，P=0.023]，處于S期細胞數目下降[（32.4±1.81）% vs.（24.2±1.54）%，P=0.026]，Hep3B細胞從G1期向S期的細胞周期轉化受到抑制（見圖3 ）。

2.3 HNK在體內實驗中對 Hep3B細胞增殖能力的影響

使用H e p 3 B 細胞系和裸鼠構建了皮下成瘤模型。與對照組相比，H N K 治療組的腫瘤體積[（0.8 6±0.3 2）vs.（0.41±0.14）cm3，P=0.012]和腫瘤重量[（0.85±0.24）vs.（0.43±0.16）g，P=0.007]均低于對照組（見圖4）。

圖1 HNK 對細胞活力的影響

圖2 HNK 對Hep3B 細胞增殖能力的影響

圖3 HNK 誘導Hep3B 細胞G1/S 期細胞周期阻滯

圖4 HNK 對Hep3B 細胞體內成瘤能力的影響

表1 cyclin D1、P53、P27 和P21 蛋白的相對表達量，n=3）

表1 cyclin D1、P53、P27 和P21 蛋白的相對表達量，n=3）

注：與0 μM HNK 治療組比較，*P ＜0．05；與20 μM HNK 治療組比較，#P ＜0．05

2.4 HNK處理對細胞周期蛋白cyclin D1、P53、P27、P21的影響

如圖5和表1所示：在HNK刺激24小時后，Hep3B中細胞周期蛋白cyclin D1表達水平下調，并呈現出劑量依賴性。同時， HNK處理后， Hep3B中細胞周期負性調節蛋白P53、P27、P21的表達水平上調。

圖5 cyclin D1、P53、P27 和P21 蛋白的Western blot 結果

3 討論

中草藥活性成分用于預防和治療癌癥已有數百年歷史，多種植物化學物質如生物堿、黃酮類、多酚化合物等均具有很大的抗癌潛力[9-10]。和厚樸酚（honokiol，HNK）是傳統中草藥厚樸的有效提取物之一，其抗腫瘤活性已在肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中得到驗證[11-13]。

本研究表明，HNK能夠在體外抑制HCC細胞Hep3B的增殖能力，這種抑制作用與誘導細胞周期G1/S阻滯有關，這與既往的相關研究結果一致[14]。為了進一步驗證HNK對于HCC的治療作用，我們構建了裸鼠皮下成瘤模型。體內實驗結果與體外實驗結果一致，結果均證實了HNK對HCC的增殖具有一定的抑制作用。

細胞周期調控涉及多種信號級聯傳導機制，包括DNA復制、細胞分裂和增殖等[15]。對G1期、S期、G2期等關鍵“檢查點”的干擾將導致癌細胞的分裂失控和過度增殖[16]。細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CDKIS）的失衡在其中起著關鍵作用[17]。細胞周期蛋白D1是細胞周期蛋白家族的一員，它可以與CDK4或CDK6形成復合物，用于調節細胞周期從G1向S期的轉變[18]。已證實，在多種腫瘤的發生發展過程中均存在細胞周期蛋白D1的過度表達并伴隨CDK活性的失調，由此引發的腫瘤細胞異常增殖[19]。由于HNK可以影響Hep3B細胞的細胞周期并抑制細胞周期從G1向S期的轉變，我們推測HNK可能通過調節細胞周期蛋白的表達來抑制Hep3B細胞的增殖。本研究中，我們發現NHK治療可以顯著下調Hep3B細胞周期蛋白cyclin D1，上調CDK抑制蛋白p21和p27。同時，HNK治療后腫瘤抑制蛋白p53的表達明顯增加，而P53已被證實與細胞周期停滯有關[20]。總之，本研究證實了NHK可能是一種天然的細胞周期蛋白cyclin D1抑制劑，其通過誘導G1/S期阻滯來抑制肝細胞癌的發生。

綜上，我們得出結論：NHK通過抑制細胞周期蛋白cyclin D1誘導細胞周期G1/S阻滯，進而抑制了Hep3B細胞在體內和體外的增殖。因此，HNK可能作為一種天然、安全、有效的肝細胞癌輔助治療藥物。