mTORC1信號通路在毛囊生長期啟動時特異促進(jìn)毛囊干細(xì)胞增殖

張亦雅 謝紅付 劉芳芬 徐傘 ，3 陳夢婷 ，3 李吉 ，2，3，4 鄧智利 ，2，3，4

1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院皮膚科，長沙 410008；2器官損傷衰老與再生醫(yī)學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410008；3中南大學(xué)湘雅醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究中心，長沙 410008；4中南大學(xué)湘雅醫(yī)院國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，長沙 410008

毛囊作為皮膚的重要附屬結(jié)構(gòu)，是人體內(nèi)出生后仍具備周期性再生能力的少數(shù)微型器官之一［1］。在整個生命過程中，毛囊一直循環(huán)經(jīng)歷周期性的生長期、退行期和靜止期，即毛囊生長周期［2-3］。位于毛囊上段、皮脂腺下端的外根鞘隆突部的毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cells，HFSC）在這一周期性的再生過程中扮演種子細(xì)胞的角色［1，4］。在毛囊從靜止期向生長期轉(zhuǎn)變時，毛囊干細(xì)胞接受來自周圍環(huán)境（主要是真皮乳頭）的信號后被激活，從而啟動毛囊生長期，并增殖分化形成毛囊外根鞘（包括毛囊前體細(xì)胞），進(jìn)一步向下遷移形成毛基質(zhì)細(xì)胞，并最終形成新的內(nèi)根鞘和毛干［5-6］。

調(diào)控毛囊周期性再生過程的信號通路主要分為兩類即激活性和抑制性信號。其中Wnt/β 聯(lián)蛋白信號能夠促進(jìn)毛囊干細(xì)胞活化和生長期啟動。與Wnt 信號相反，骨形成蛋白信號對毛囊干細(xì)胞維持相對靜止?fàn)顟B(tài)具有關(guān)鍵作用，在毛囊干細(xì)胞活化過程中起抑制作用［7-8］。我們研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物西羅莫司靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）信號通路在毛囊生長周期中發(fā)生周期性激活，并在毛囊生長期啟動即毛囊干細(xì)胞活化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而調(diào)控毛發(fā)再生過程［9］。但是關(guān)于mTORC1 信號通路在毛囊生長期啟動過程中發(fā)揮作用的窗口期仍不清楚，且其是否還調(diào)控其他毛囊細(xì)胞的增殖也未見研究。本研究擬通過利用mTORC1 的特異抑制劑西羅莫司［9］在毛囊生長期啟動的不同階段抑制小鼠皮膚mTORC1信號，探索該信號通路發(fā)揮作用的窗口期，及其對其他毛囊細(xì)胞增殖的影響，為進(jìn)一步研究mTOR 信號通路在毛發(fā)再生中的功能與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

用于繁殖的 15 只（10 雌 5 雄）SPF 級 8 周齡（體重約20 g）ICR 小鼠（實(shí)驗(yàn)動物合格證號：110059764）來自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于本校醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動物中心無特定病原體（specific pathogen free，SPF 級）環(huán)境中，動物實(shí)驗(yàn)許可證號：SYXK（湘）2015-0014。小鼠健康狀況良好，自由飲水取食，人工控制光照（12 h 光照，12 h 黑暗）。將小鼠按照1 雄2 雌合籠繁殖，獲得新生小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。研究方法與過程均符合中南大學(xué)湘雅醫(yī)院動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定及要求。

二、主要試劑及實(shí)驗(yàn)儀器

兔抗小鼠pS6（Ser235/236，細(xì)胞mTORC1 信號激活的下游標(biāo)志分子）抗體、CD34（毛囊干細(xì)胞標(biāo)志分子）抗體、Ki67（細(xì)胞增殖標(biāo)志分子）抗體（美國CST公司），大鼠抗小鼠鈣黏蛋白（Pcad）抗體（美國R&D 公司），正常羊血清/驢血清（美國Jackson ImmunoResearch公司），Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗兔IgG 熒光二抗（美國ThermoFisher 公司），Alexa Fluor 488 標(biāo)記的驢抗大鼠IgG 熒光二抗（英國Abcam 公司），4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（美國Sigma公司）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.ICR小鼠分組及處理：36只新生小鼠隨機(jī)分為對照組、RAPA-P19組、RAPA-P21組，每組12只。剃毛后，RAPA-P19組于出生后第19 ～24天、RAPAP21 組于出生后第21 ～ 24 天每天下午4 點(diǎn)腹腔注射西羅莫司，劑量為 5 mg·kg-1·d-1［10］，對照組在第19 ～24天腹腔注射同等體積的溶劑。

2.取材：各組小鼠分別于第 22、23、24 天斷頸處死（各4 只），剃除背毛，用眼科剪和鑷子取背部剃毛區(qū)域皮膚用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.蘇木精-伊紅（HE）染色：將部分新鮮小鼠皮膚組織用4%多聚甲醛固定后，按常規(guī)制做切片并行HE染色。顯微鏡下觀察。

4.免疫熒光染色：部分新鮮小鼠皮膚-80 ℃速凍，制作冰凍切片。將8 μm 厚的冰凍切片在室溫下晾干10 min，用4%多聚甲醛在室溫下固定10 min，PBS沖洗3次，每次5 min。然后用5%正常羊血清/驢血清封閉液（含0.3%Triton X-100 和1%牛血清白蛋白）于室溫下孵育切片1 h，封閉非特異性抗原。棄封閉液，在切片上加一抗溶液，4 ℃孵育過夜；陰性對照以封閉液代替一抗。次日，用PBS洗滌切片3次，每次15 min，然后加入用封閉液稀釋（1∶150）的相應(yīng)熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育1 h，PBS 清洗。用1 mg/L 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚在室溫孵育切片5 min，復(fù)染細(xì)胞核，PBS 洗2次，每次5 min。蓋玻片覆蓋封片后儲存于-20 ℃，1 周之內(nèi)用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖片。

5.圖片處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：HE 染色和免疫熒光染色采集的圖片用Photoshop CS5和Image J軟件處理。采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，多重檢驗(yàn)采用Tukey法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同階段抑制mTORC1信號對毛囊周期的影響

HE 染色顯示，在出生后第24 天時，對照組小鼠毛囊毛球膨大且延伸入脂肪層，毛干明顯變粗，呈現(xiàn)明顯生長期形態(tài)；RAPA-P19 組小鼠毛囊毛乳頭仍緊鄰隆突部，且未伸入脂肪層，為明顯靜止期形態(tài)；但是，RAPA-P21 組小鼠毛囊和對照組一樣，毛球明顯膨大，毛干增粗且延伸入脂肪層，呈現(xiàn)生長期形態(tài)，見圖1。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，對照組和RAPAP21組毛囊進(jìn)入生長期的比例分別為95%±3.74%和 94% ± 2.16%，而 RAPA-P19 組僅為 2.25% ±2.21%，3 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 144，P ＜0.001），且 RAPA-P19 組與對照組和 RAPA-P21 組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 值分別為-42.65 和-59.28，均P ＜ 0.01），而對照組與RAPA-P21 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.46，P=0.871）。

二、不同階段抑制mTORC1信號對毛囊干細(xì)胞及其他細(xì)胞增殖的影響

免疫熒光共染色結(jié)果表明，在第22 和23 天時對照組毛囊干細(xì)胞pS6 明顯陽性，RAPA-P19 組和RAPA-P21組毛囊中均未見pS6陽性的毛囊干細(xì)胞（圖2A）。而且，對照組毛囊干細(xì)胞Ki67 明顯陽性，RAPA-P19 組毛囊中未見Ki67 陽性毛囊干細(xì)胞，但是RAPA-P21 組毛囊中大部分毛囊干細(xì)胞Ki67也為陽性（圖2B）。

在第23 天時，與對照組一樣，RAPA-P19 組和RAPA-P21組毛囊中除毛囊干細(xì)胞以外的其他細(xì)胞如皮脂腺細(xì)胞、毛囊隆突部上端的表皮細(xì)胞等Ki67均陽性，見圖3。

討 論

mTOR是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為整合營養(yǎng)利用、能量狀態(tài)、細(xì)胞應(yīng)激源以及生長因子的信號通路調(diào)節(jié)中樞，它參與調(diào)節(jié)生物體的生長和穩(wěn)態(tài)，以及細(xì)胞增殖與存活等生理過程［11-12］。mTOR 可與其他蛋白組合形成兩種不同的蛋白復(fù)合物，即對西羅莫司敏感的復(fù)合物mTORC1和對西羅莫司不敏感的復(fù)合物mTORC2，且它們在真核生物中都功能保守［10］。我們先前研究發(fā)現(xiàn)，在毛囊生長周期中，mTORC1信號通路在毛囊干細(xì)胞中呈周期性的活化，并在毛囊生長期啟動中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。本研究中，我們進(jìn)一步通過西羅莫司抑制毛囊中的mTORC1 信號，并結(jié)合HE 染色和免疫熒光共染色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)mTORC1信號通路在毛囊從靜止期向生長期轉(zhuǎn)變過程中特異性促進(jìn)毛囊干細(xì)胞的增殖。

毛囊從靜止期向生長期轉(zhuǎn)變，即毛囊干細(xì)胞活化階段是毛囊進(jìn)入生長期的關(guān)鍵時期。在此過程中，毛囊干細(xì)胞的增殖尤為重要［4，13］。本研究顯示，在生長期啟動前抑制mTORC1 信號能有效阻斷毛囊干細(xì)胞的增殖，但是在生長期啟動后，即毛囊干細(xì)胞活化后，抑制mTORC1并不能明顯抑制毛囊干細(xì)胞的增殖，說明在毛囊進(jìn)入生長期的過程中，mTORC1 信號通路存在一個發(fā)揮作用的關(guān)鍵窗口期，而這個窗口期即為毛囊干細(xì)胞活化的時期。我們前期研究提示，在這個窗口期內(nèi)，mTORC1 可能通過克服高水平的骨形成蛋白信號來促進(jìn)毛囊干細(xì)胞的增殖［9］。但是關(guān)于在這個窗口期誘發(fā)mTORC1 信號通路活化的上游信號仍需進(jìn)一步研究。

圖1 HE染色檢測不同階段抑制mTORC1信號對毛囊生長周期的影響 在第24天時，對照組和西羅莫司第21天處理組（RAPA-P21組）毛囊呈生長期形態(tài)，而第19天處理組（RAPA-P19組）毛囊仍呈靜止期形態(tài)。各圖放大倍數(shù)相同，標(biāo)尺為50 μm

圖2 免疫熒光共染色檢測不同階段抑制mTORC1信號對毛囊干細(xì)胞增殖的影響 2A：在第22（P22）和23天（P23）時，對照組毛囊干細(xì)胞pS6陽性，而西羅莫司第19天處理組（RAPA-P19組）和RAPA-P21組毛囊干細(xì)胞均pS6陰性。2B：在第22和23天時，對照組和RAPA-P21組中毛囊干細(xì)胞Ki67陽性，而RAPA-P19組毛囊干細(xì)胞未見Ki67陽性信號

圖3 第23天時免疫熒光共染色檢測抑制mTORC1信號對毛囊中非干細(xì)胞增殖的影響 對照組、西羅莫司第19天處理組（RAPA-P19組）和21天處理組（RAPA-P21）3組毛囊中皮脂腺和其他毛囊細(xì)胞均可見明顯Ki67核定位

既往研究顯示，mTOR 信號通路可促進(jìn)成體干細(xì)胞增殖，例如造血干細(xì)胞［12，14-15］。與既往研究一致，本研究顯示，抑制mTORC1 信號能夠抑制毛囊干細(xì)胞的增殖，卻不會影響毛囊中其他細(xì)胞的增殖，說明mTORC1信號促進(jìn)毛囊干細(xì)胞的增殖具有時空特異性。在毛發(fā)再生過程中，毛囊干細(xì)胞的增殖與分化起著關(guān)鍵性作用［6］，mTORC1 信號在這一過程中可特異性促進(jìn)毛囊干細(xì)胞的增殖，該結(jié)果也進(jìn)一步凸顯mTORC1 信號通路在促進(jìn)毛發(fā)再生中的重要性。

綜上所述，在毛囊從靜止期向生長期轉(zhuǎn)變過程中，mTORC1信號通路可特異性促進(jìn)毛囊干細(xì)胞的增殖，這為臨床治療脫發(fā)提供了一個潛在的靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突