γ分泌酶抑制劑阻斷Notch-Hes1信號通路對銀屑病樣皮炎小鼠γδT17細胞表達的影響

王燕芹 李新新 薛海波 紀洪 孫大康 馬蕾

1濱州醫學院附屬醫院皮膚科，山東 256603；2濱州醫學院附屬醫院內分泌與代謝病科，山東 256603；3濱州醫學院附屬醫院病理科，山東 256603；4濱州醫學院附屬醫院臨床醫學實驗室，山東 256603

銀屑病是一種免疫介導的慢性炎癥性皮膚病，近來研究發現，白細胞介素17A（IL-17A）在銀屑病的發病機制中發揮關鍵作用［1-3］，且臨床試驗證實，IL-17A及IL-17受體拮抗劑治療中重度斑塊狀銀屑病療效確切［4-5］。在銀屑病皮損中，許多免疫細胞分泌IL-17A，T 細胞是其最主要來源［6］。以往研究提示，IL-17A 主要由 Th17 細胞產生［7-8］。新近研究顯示，γδ T17 細胞亦是銀屑病皮損中IL-17A 的主要來源T細胞［6，9］。Notch信號通路是一種高度保守的信號轉導通路，在銀屑病的發生發展中發揮重要作用［10］，且 Notch 信號通路下游靶基因 Hes1 對γδT17 細胞分化發育及 IL-17A 產生至關重要［11］。目前尚無Notch-Hes1 信號通路對銀屑病γδT17 細胞表達及其IL-17A分泌影響的研究報道。我們用5%咪喹莫特構建小鼠銀屑病樣皮炎模型，以γ 分泌酶抑制劑阻斷Notch-Hes1信號通路，探討在銀屑病狀態下，阻斷Notch-Hes1信號通路對γδT17細胞表達及IL-17A分泌的影響。

材料與方法

一、材料

1.小鼠：雄性健康 SPF 級 BALB/c 小鼠產自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司（動物合格證號：37009200014339），6 周齡，體重（18 ± 2）g，飼養于濱州醫學院附屬醫院SPF 動物房［動物實驗許可證號SYXK（魯）20180022］，室溫23 ℃ ± 1 ℃，照度15 ～20 Lx，晝夜明暗交替時間12 h/12 h（光照時間為每天7：00 ～ 19：00），自由取食（標準滅菌飼料和高壓蒸氣滅菌用水），實驗過程遵循減少、替代、優化的3R原則。

2.主要試劑和儀器：5%咪喹莫特乳膏（英國3M Health Care Limited 公司），γ 分泌酶抑制劑（2S）-N-N-（3，5-二氟苯乙酰基）-L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT，純度99%，美國Selleck 公司），異硫氰酸熒光素標記的CD3單克隆抗體、藻青蛋白標記的γδT 單克隆抗體、藻紅蛋白標記的IL-17A 單克隆抗體、細胞刺激劑（美國eBioscience 公司），固定/破膜劑、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）（美國Thermo Fisher 公司），膠原蛋白酶Ⅳ（美國Sigma 公司），Trizol RNA 提取試劑（美國Invitrogen公司），GoScript ?逆轉錄酶系統、GoTaq?qPCR Master Mix（美國Promega公司），IL-17A酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司），玉米油（美國Sigma公司），DMEM培養基、紅細胞裂解液、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS，上海生工生物工程股份有限公司），FACS Calibur 流式細胞儀（美國BD 公司），Rotor-Gene 3000 實時PCR儀（澳大利亞Corbett Research公司），酶聯免疫檢測儀（美國Thermo公司）。

二、方法

1.小鼠分組：將45 只雄性SPF 級健康BALB/c小鼠按照簡單隨機抽樣法分為對照組、模型組和干預組，每組15只，用動物專用剃刀剃去小鼠背部約2 cm×3 cm范圍的被毛，電動剃須刀剃去毳毛。模型組和干預組小鼠每天涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg 于脫毛處，對照組小鼠涂抹等劑量白凡士林；先將DAPT 溶解于二甲基亞砜配成儲存液（10 g/L），再以玉米油溶解DAPT 儲存液配成工作液（0.2 g/L），在涂抹咪喹莫特后立即給予干預組小鼠腹腔注射DAPT（10 mg/kg）工作液，模型組及對照組小鼠腹腔注射等劑量玉米油。以上處理每天1次，連續6 d。每天記錄3組小鼠皮損變化，第7天麻醉小鼠，剪破心臟取血，取脾臟及皮膚組織完成實驗。本研究經醫院實驗動物倫理委員會討論通過（編號20190104-15）。

2.各組小鼠銀屑病樣皮炎嚴重程度評分：用數碼相機每天拍照記錄小鼠皮損變化，計算銀屑病皮損嚴重程度指數（psoriasis area and severity index，PASI）。紅斑、鱗屑、浸潤厚度按0 ～ 4 分計分，0 分為與處理前相比無變化，1 分為輕度，2 分為中度，3分為重度，4分為極重度，累加后得到總積分［12］。

3.小鼠皮膚組織病理學檢查：剪取背部0.5 cm×0.5 cm 的皮膚組織，4%多聚甲醛固定，經石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色后于顯微鏡下觀察。

4.脾指數計算：稱量小鼠體重及脾重，計算脾指數（脾重/體重，mg/g）。

5.小鼠脾臟單細胞懸液制備：取出脾臟，用5 ml注射器芯在200目鋼網上研磨，將細胞懸液移入離心管中，4 ℃、400 × g 離心10 min，棄上清液，加入紅細胞裂解液重懸細胞，加入預冷PBS終止反應，4 ℃、400× g離心10 min，棄上清液，再次加PBS重懸細胞，重復1 次上述離心步驟，加入含15%FBS 和1%青鏈霉素的DMEM 重懸細胞，計數并調至1 × 106細胞/ml。

6.小鼠皮膚組織單細胞懸液制備：將皮膚組織剪成0.5 cm×0.5 cm 大小置于培養皿中，加入胰蛋白酶，37 ℃孵育2 h。進一步剪碎皮膚組織并轉移至離心管中，依次加入DMEM 培養基、含10%FBS的DMEM 培養基、膠原蛋白酶Ⅳ、PBS、DNaseⅠ，37 ℃、90 r/min（振幅29 mm）振蕩1 h。加入含10%FBS 的DMEM 培養基終止反應，過濾，1 250 r/min（半徑18 cm）離心6 min，棄上清液。加PBS重懸細胞，1 250 r/min（半徑18 cm）離心6 min，棄上清液。PBS重懸細胞，計數并調至1×106細胞/ml。

7.流式細胞儀檢測γδT17 細胞比例：取脾臟、皮膚組織單細胞懸液各1 ml（約106個細胞）置于24 孔板，加入細胞刺激劑即佛波醇-十四酸酯-乙酸酯和離子霉素的混合物，37 ℃、5%CO2環境下共刺激培養4 h。取約105個細胞于流式管中，加入異硫氰酸熒光素-CD3、藻青蛋白-γδT 單克隆抗體室溫下避光15 min 標記細胞膜；加入固定劑，室溫下避光15 min，洗滌重懸細胞；加入透膜劑、藻紅蛋白-IL-17A 室溫下避光20 min，應用流式細胞儀檢測。

8.實時定量反轉錄PCR 檢測脾臟Hes1 mRNA表達水平：采用Trizol RNA 提取試劑抽提小鼠脾細胞總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度儀測定其純度，吸光度比值（A260/A280）在1.8 ～ 2.0之間為合格樣本。采用GoScript?逆轉錄酶系統將RNA 逆轉錄合成cDNA，以β 肌動蛋白為內參照，采用GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒于Rotor-Gene 3000 real-time PCR 儀上進行檢測。PCR 反應體系：cDNA 模板 1 μl，正向引物（2 μmol/L）2 μl，反向引物（2 μmol/L）2 μl，GoTaq?qPCR Master Mix（2×）10 μl，RNase-free 去離子水5 μl；反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共擴增40 個循環。以目的基因和內參基因拷貝數的比值表示Hes1 mRNA表達水平。

9.ELISA檢測血清IL-17A含量：將血液標本室溫下靜置2 h，收集上層血清，按照小鼠IL-17A ELISA試劑盒說明書的操作標準進行檢測。

10.統計學處理：PASI 評分比較采用單因素重復測量方差分析；其他指標比較采用單因素方差分析，組間比較采用最小顯著差法。不同指標間相關性評價采用Pearson相關分析。采用SPSS17.0統計學軟件進行數據分析，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、小鼠一般情況及皮損形態、組織病理學改變

圖1 咪喹莫特乳膏單獨或聯合γ分泌酶抑制劑處理6 d后小鼠背部皮膚表現 1A：對照組；1B：模型組；1C：干預組

所有實驗鼠完成全部造模及干預過程，無死亡及其他特殊情況發生。末次處理24 h 后對照組小鼠皮膚較薄，無紅斑、鱗屑及皮膚增厚改變；模型組小鼠皮膚出現明顯紅斑、鱗屑及浸潤增厚；干預組小鼠皮膚紅斑、鱗屑及浸潤增厚現象較模型組明顯減輕，見圖1。PASI評分見圖2。對照組PASI評分始終為0，模型組造模第2 天開始持續增加，至第6天達到最高值，干預組PASI評分與模型組變化趨勢相似，但較模型組顯著降低。重復測量方差分析顯示，對照組、模型組、干預組3組間PASI評分差異有統計學意義（F=602.15，P ＜ 0.01），且組間兩兩比較差異均有統計學意義（均P ＜0.01）；不同觀察時間點差異亦有統計學意義（F = 615.70，P ＜0.01），進一步組間比較顯示，除PASI 評分在第5、6天之間差異無統計學意義外，其他各觀察點之間差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。并且，時間和組別對PASI 評分的影響具有交互作用（F =170.47，P ＜ 0.01）。

HE 染色顯示，對照組小鼠表皮層菲薄，僅由1 ～2層表皮細胞構成。模型組小鼠表皮層明顯增厚，可見角化過度伴角化不全，部分區域可見Munro 微膿腫，表皮層細胞數量增加，表皮突向下延伸，真皮炎癥細胞大量浸潤，真皮淺層可見血管擴張。干預組小鼠表皮增厚及真皮炎癥細胞浸潤程度較模型組明顯減輕。見圖3。

二、小鼠脾指數及脾臟γδT17 細胞比例、Hes1 mRNA表達水平

1.脾指數：見表1。3 組間小鼠脾指數差異有統計學意義（P ＜0.01），組間兩兩比較顯示，模型組小鼠脾指數明顯高于對照組（t=14.20，P＜ 0.01），干預組顯著低于模型組（t=-6.37，P＜ 0.01），干預組與對照組差異有統計學意義（t=7.83，P＜0.01）。

圖2 銀屑病樣皮炎小鼠背部皮膚銀屑病皮損嚴重程度指數（PASI）隨時間變化曲線

圖3 銀屑病樣皮炎小鼠皮膚組織病理學變化（HE×200） 3A：對照組小鼠表皮層菲薄，僅由1 ～2層表皮細胞構成；3B：模型組小鼠表皮層明顯增厚，角化過度伴角化不全，表皮突向下延伸，真皮炎癥細胞大量浸潤，真皮淺層可見血管擴張；3C：干預組小鼠表皮增厚及真皮炎細胞浸潤較模型組明顯減輕

2.γδT17 細胞比例：見表 1、圖 4。3 組間小鼠脾臟γδT17 細胞比例差異有統計學意義（P＜0.01），而且組間兩兩比較顯示，模型組顯著高于對照組（t= 9.40，P＜ 0.01），干預組明顯低于模型組（t=-5.77，P＜ 0.01），干預組與對照組間差異有統計學意義（t=3.64，P＜ 0.01）。

3.Hes1 mRNA表達水平：3組間小鼠脾臟單細胞懸液中Hes1 mRNA表達水平差異有統計學意義（P＜0.01），組間兩兩比較顯示，模型組顯著高于對照組（t= 20.43，P＜ 0.01），干預組低于模型組（t=-14.23，P＜ 0.01），干預組與對照組間差異有統計學意義（t=6.19，P＜ 0.01），見表1。

表1 銀屑病樣皮炎小鼠脾指數、γδT17細胞比例、脾臟Hes1 mRNA表達水平及血清白細胞介素17A含量（±s）

表1 銀屑病樣皮炎小鼠脾指數、γδT17細胞比例、脾臟Hes1 mRNA表達水平及血清白細胞介素17A含量（±s）

組別對照組模型組干預組F值P值只數15 15 15脾指數5.658±1.232 12.534±1.636 9.449±1.040 101.15＜0.01 γδT17細胞比例（%）脾臟8.858±3.009 24.659±4.603 14.966±5.770 44.97＜0.01皮膚9.399±3.529 22.127±5.670 13.631±5.946 23.65＜0.01 Hes1 mRNA 1.581±0.396 4.867±0.543 2.541±0.347 219.40＜0.01血清白細胞介素17A（ng/L）14.767±1.400 22.478±2.776 18.639±1.816 51.60＜0.01

圖4 流式細胞儀檢測銀屑病樣皮炎小鼠脾臟γδT17 細胞比例 γδTCR-APC，藻青蛋白標記的γδT 細胞受體單克隆抗體；IL-17A-PE，藻紅蛋白標記的白細胞介素17A單克隆抗體

圖5 銀屑病樣皮炎小鼠脾臟γδT17 細胞比例與血清白細胞介素17A（IL-17A）水平相關性分析（n=15）

三、小鼠皮膚組織中γδT17細胞比例

3組小鼠皮膚組織中γδT17細胞比例差異有統計學意義（P＜0.01），組間兩兩比較顯示，模型組明顯高于對照組（t=6.75，P＜ 0.01），干預組較模型組顯著降低（t=-4.51，P＜ 0.01），見表1。

四、小鼠血清中IL-17A含量

方差分析顯示，3組間小鼠血清中IL-17A含量差異有統計學意義（P＜0.01），而且組間兩兩比較顯示，模型組明顯高于對照組（t=10.16，P＜ 0.01），干預組則較模型組降低（t=-5.06，P＜ 0.01），見表1。

五、相關性評價

模型組及干預組小鼠脾臟γδT17 細胞比例與血清IL-17A 含量均呈正相關（r值分別為0.56 和0.53，均P＜ 0.05），見圖5；皮膚組織中γδT17 細胞比例與 PASI 均呈正相關（r值分別為 0.56 和 0.52，均P＜ 0.05），見圖6。

模型組及干預組小鼠脾臟Hes1 mRNA表達水平與γδT17 細胞比例均呈正相關（r值分別為0.61和0.58，均P＜ 0.05），與血清IL-17A 水平亦均呈正相關（r值分別為0.60和0.54，均P＜ 0.05）。見圖7。

圖6 銀屑病樣皮炎小鼠皮膚組織γδT17 細胞比例與銀屑病皮損嚴重程度指數（PASI）相關性分析（n=15）

討 論

免疫系統應答失調在銀屑病疾病過程中發揮關鍵作用，目前認為T17細胞是最重要的致病因素之一［6，12-13］。T17 細胞包括 Th17、Tc17 和 γδT17 細胞，均能分泌IL-17等細胞因子。IL-17細胞因子家族包括6個成員，IL-17A是該家族最先發現也是最具標志性的細胞因子。大量研究已證實，IL-17A在銀屑病發生及發展過程中發揮重要作用，能夠促進角質形成細胞增殖，抑制角質形成細胞分化，破壞皮膚屏障，誘導多種前炎癥細胞因子和趨化因子的表達分泌，啟動并加重炎癥反應［2-3，14-15］。在銀屑病樣皮炎動物模型研究中，同樣證實了IL-17A 的致病作用［16］。臨床試驗證實，阻斷IL-17A 或其受體對中重度斑塊狀銀屑病療效確切［4-5］。本研究結果顯示，銀屑病樣皮炎小鼠脾臟及皮膚組織中γδT17細胞比例均明顯高于對照組，且脾臟γδT17細胞比例與血清IL-17A含量呈正相關，皮膚組織中γδT17細胞比例與皮損PASI呈正相關，進一步證實γδT17細胞在銀屑病發病機制中的重要作用［6］。

圖7 銀屑病樣皮炎小鼠脾臟Hes1 mRNA表達水平與γδT17細胞比例、血清白細胞介素17A（IL-17A）含量相關性分析（n=15）

Notch信號通路作為一種高度保守的信號轉導通路，在細胞分化、發育過程中尤其是在T 淋巴細胞分化中起關鍵作用［17］。Notch 信號通路由 4 種Notch 受體、5 種 Notch 配體、CSL（CBF1/Suppressor of hairless/Lag1）DNA 結合蛋白、其他效應物和Notch 調節分子等組成。Notch 配體與受體相互作用，在Notch受體分子的S2和S3兩個位點發生連續切割，S3 被依賴早老素、包含γ 分泌酶的復合物切割后，釋放出具有核定位信號的胞質區（Notch intracellular domain，NICD），NICD 轉移至細胞核并形成NICD/CSL轉錄激活復合體，從而激活靶基因，發揮生物學作用。γ 分泌酶抑制劑能夠作用于早老素分子，從而阻斷γ分泌酶的作用，減少NICD的產生，下游信號分子由于NICD 的啟動作用缺少或減弱而處于靜止或下調狀態。Notch信號通路在銀屑病發病機制中的作用已有諸多報道［10］，本研究結果證實，γ 分泌酶抑制劑DAPT 阻斷Notch 信號后，銀屑病樣皮炎小鼠皮損嚴重程度明顯改善，PASI降低，組織病理檢查亦表明其表皮增厚及真皮炎癥細胞浸潤程度較模型組明顯減輕。

在小鼠和人促Th17細胞分化的細胞因子環境中均有Notch 信號通路的活化，以γ 分泌酶抑制劑及siRNA 特異性阻斷Notch1 信號通路能夠降低Th17 細胞特異性轉錄因子RORγt 的表達，抑制其產生IL-17A 及相關炎癥反應進程［18-19］。本課題組前期研究表明，用γ分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號通路能夠降低銀屑病患者及模型小鼠外周血與脾臟單個核細胞中Th17 細胞比例、RORγt 及IL-17A 的表達［20-21］。RORγt 對于 Th17 細胞的分化必不可少，然而γδT17細胞在胸腺內的發育分化僅部分依賴RORγt［11，22］。Hes1是Notch信號通路下游的重要靶基因，對γδT17細胞的分化發育及其產生IL-17A 至關重要：在Hes1 基因缺陷的小鼠胸腺內γδT細胞數量較正常小鼠降低，且具備分泌IL-17A能力的γδT17 細胞數量降低更顯著，脾臟內產生IL-17A 的γδT17 細胞數量亦明顯降低；將轉染有Notch1 胞內段NICD1 的胎肝細胞移至經放射線照射的小鼠，其胸腺內Hes1 表達水平及γδT17 細胞數量顯著增加［11］。本研究結果顯示，銀屑病樣皮炎小鼠脾臟Hes1 mRNA 表達水平、脾臟及皮膚組織中γδT17 細胞比例均顯著增高，DAPT 能明顯降低Hes1的表達水平及γδT17細胞比例，且模型組和干預組小鼠脾臟Hes1 表達水平均與γδT17 細胞比例及IL-17A 血清含量呈正相關，進一步說明銀屑病狀態下Notch-Hes1 信號通路對γδT17 細胞表達及分泌IL-17A的調控作用。

結合以往及本次研究結果，我們認為Notch-Hes1信號通路分別通過不同的轉錄因子途徑對銀屑病IL-17A 兩大主要來源細胞即Th17 細胞和γδT17細胞進行表達調控，促進其產生分泌IL-17A，增強其致炎效應，加重銀屑病皮損的炎癥反應，阻斷Notch-Hes1 信號通路可能是銀屑病免疫治療的新策略。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突