顱腦損傷誘導聯合應用他克莫司促進周圍神經再生實驗研究*

何新澤，楊 濤，林書卿，李 芹，王成剛，高麗麗，于立志，孫金占，王 培

1.山東省濱州市中心醫院(濱州251700)；2.承德醫學院附屬醫院手足外科(承德067000)

顱腦損傷合并周圍神經損傷并不罕見，神經損傷后的恢復具有特殊性，功能恢復不全，致殘率較高[1-6]。Wang、何新澤等研究發現，實驗大鼠在顱腦損傷后合并周圍神經損傷，損傷坐骨神經的修復速度加快，但修復機制尚不清楚[2-8]。研究發現他克莫司可促進損傷神經修復再生[3-14]。大量的實驗發現，他克莫司促進周圍神經損傷后的再生，主要通過免疫抑制、神經營養來實現[15-24]。本實驗擬通過他克莫司促進神經損傷恢復機制，探索顱腦損傷促進神經損傷恢復的機制。

材料和方法

1 造模動物及材料 實驗在2018年10月至2019年2月在濱州市中心醫院完成。

1.1 實驗動物：選用SPF級雄性SD大鼠180只，200～220 g[北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK (京) 2012-0001]。飼養在晝夜各12 h節律下，實驗室溫度維持在(23±1)℃。將大鼠完全隨機分為四組，每組45只。實驗經過濱州市中心醫院倫理委員會批準，按照國際動物實驗標準執行。

1.2 主要設備及試劑：手術顯微鏡(LZL-6A型，鎮江中天公司)，光學顯微鏡(BH-3型，Olympus公司)，電子分析天平(ESJ200-4 ±0.0001g)，他克莫司(Tacrolimus)100mg(Selleck)，Masson三色染色試劑盒(標準型，江蘇Key GEN生物)，Peroxidase來源于辣根100mg(Sigma)。

2 研究方法

2.1 造模：禁食水4 h，術前30 min，肌肉注射頭孢唑啉鈉10 mg/100g預防感染，術區備皮剪毛。10%水合氯醛按照0.35 ml/100g進行腹腔全麻。A組(顱腦損傷+坐骨神經損傷)：消毒，沿頭部正中矢狀切開，在顱骨冠狀線后1.5 mm、中線偏左5 mm處開直徑5 mm骨窗，撞擊造成中度腦損傷；右側臀部，顯微鏡下完全切斷坐骨神經，9-0無損傷線縫合坐骨神經外膜4～6針[11]。B組 (坐骨神經損傷)：SD大鼠僅于顯微鏡下完全切斷右側坐骨神經，縫合坐骨神經外膜。

2.2 造模后的干預：分籠飼養在同樣環境中。他克莫司用0.9%氯化鈉稀釋，1 ml 0.9%氯化鈉+1 mg他克莫司，現用現配制，4℃恒溫保存；造模手術12 h后，A1組SD大鼠給予他克莫司按1 mg/200 mg腹腔注射，A2組給予生理鹽水按1 ml/200 mg腹腔注射，B1組大鼠給予他克莫司按1 mg/200 mg腹腔注射，B2組大鼠給予生理鹽水按1 ml/200 mg腹腔注射。每日應用1次，連續2周。SD大鼠均存活。

3 觀察指標

3.1 坐骨神經指數(Sciatic nerve function index，SFI)的測量：分別于造模后4、8、12周，每組每次隨機取10只大鼠。根據Schiaveto de Souza A方法[8]，實驗側足3個參數分別為：實驗側足印長度(SPL)、實驗側足趾寬度(STS)、實驗側中間足趾距離(SIT)；正常側足3個參數分別為正常側足印長度(ZPL)、正常側足趾寬度(ZTS)、正常側中間足趾距離(ZIT)。

3.2 腓腸肌恢復率:造模手術4周、8周、12周，每組隨機取5只大鼠，取下完整的雙側腓腸肌，吸取肌肉周圍的血液，雙側腓腸肌在分析天平上稱重。計算腓腸肌的恢復率，推測運動功能恢復的情況。

3.3 神經Masson染色：第4周、第8周、第12周，隨機取5只大鼠，切取吻合口遠、近端0.5 cm坐骨神經，10%甲醛固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚度5 μm，染色、封片，光學顯微鏡下觀察神經纖維、膠原纖維增生情況。

3.4 辣根過氧化物酶(HRP)示蹤：分別于造模術后第8周、第12周，于坐骨神經斷端以遠0.5 cm處，注入30%HRP溶液5 μl。深麻醉下開胸，灌流固定，取坐骨神經相應脊髓節段，橫斷面連續振蕩切片30 μm。光鏡下觀察脊髓前角運動神經元中被標記為藍染顆粒的胞體數目。

4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件，組間均數比較采用SNK-q檢驗；計數資料間接化法計算率，進行統計分析，以P<0.01為差異有統計學意義。

結 果

1 造模后大鼠基本生活狀態 造模后所有動物均存活，未發現切口感染情況。造模手術后5 d B2組SD大鼠出現足部紅腫明顯，其他組紅腫較輕。3周后，A2、B1、B2組SD大鼠足跟出現程度不同的潰瘍面，A1組SD大鼠足部未見明顯潰瘍；12周時，各組SD大鼠足部潰瘍基本痊愈，B2組SD大鼠出現足部的自食現象。

2 大鼠坐骨神經功能指數(SFI) 暗箱測試結果顯示，造模后第4周，A1組與A2組、B1組與B2組SD大鼠的坐骨神經功能指數接近(P>0.05)，A1組坐骨神經功能指數優于B1組、B2組，A2組坐骨神經功能指數優于B1、B2組(P<0.01)；第4周后大鼠坐骨神經功能指數逐漸降低，第8、12周時，A2組與B1組大鼠坐骨神經功能指數接近(P>0.05)，A1組坐骨神經功能指數優于A2、B1、B2組大鼠，A2組坐骨神經功能指數優于B2組，B1組坐骨神經功能指數優于B2組(P<0.01)。見表1。

表1 腦損傷、他克莫司對周圍神經損傷大鼠坐骨神經功能指數的影響

3 腓腸肌恢復率 4周后取材可見各組大鼠失神經支配的腓腸肌顏色均較健側蒼白，肌肉明顯萎縮，8周、12周后A1組、A2組、B1組大鼠神經損傷側腓腸肌恢復明顯優于B2組。4周后，A2組大鼠腓腸肌恢復率與B1組、B2組大鼠腓腸肌恢復率、B1組大鼠腓腸肌恢復率與B2組大鼠腓腸肌恢復率比較差異無統計學意義(P>0.01)，A1組大鼠腓腸肌恢復率優于A2組、B1組、B2組大鼠腓腸肌恢復率(P<0.01)；4周后四組大鼠出現腓腸肌恢復率升高，第8、12周時，A1組與A2組大鼠腓腸肌恢復率比較差異無統計學意義(P>0.05)，A1組大鼠的腓腸肌恢復率優于B1組、B2組、A2組、B1組大鼠的腓腸肌恢復率優于B2組大鼠腓腸肌恢復率(P<0.01)；術后8周A2組大鼠腓腸肌恢復率優于B1組大鼠腓腸肌恢復率(P<0.01)；術后12周A2組與B1組大鼠腓腸肌恢復率比較無明顯統計學差異(P>0.01，圖1)。

4 神經Masson三色法染色 造模4周后A1組、B1組神經纖維紅染較多，綠色纖維較少，A2組綠染與紅染均勻，B2組未見紅染的神經纖維；造模8周后A1組、A2組、B1組可見綠染與紅染均勻分布，B2組可見再生的軸突；造模12周后A1組膠原纖維均勻分布，并呈波浪形隨神經纖維排列，A2組、B1組可見綠染與紅染分布均勻，B2組可見大量膠原纖維，少量再生的軸突(圖2)。

圖1 腦損傷、他克莫司對周圍神經損傷大鼠

圖2 坐骨神經Masson三色染色(×400)

圖3 辣根過氧化物酶(HPR)聯苯胺染色(×400)

5 神經元HRP標記 光鏡下，觀察到相應脊髓節段的前角神經元細胞胞漿中發現標記成藍黑色的HRP陽性顆粒細胞(圖3)。每高倍視野下進行計數，統計分析結果；造模后第8周，各組脊髓神經元胞漿HRP標記陽性率比較差異有統計學意義(P<0.01)，A1組脊髓前角陽性標記率高于A2組、B1組、B2組，A2組HRP標記細胞陽性率高于B1組、B2組，B1組HRP標記陽性率高于B2組；第12周時，A2組HRP標記脊髓前角陽性率與B1組大鼠脊髓神經元胞漿HRP標記陽性率接近(P>0.01)，A1組HRP標記脊髓前角陽性率高于A2組、B1組、B2組，A2組HRP標記脊髓前角陽性率高于B2組，B1組HRP標記陽性率高于B2組(P<0.01)(圖4)。

圖4腦損傷、他克莫司對周圍神經損傷大鼠脊髓神經元HRP標記陽性率(%)的影響(神經元胞漿中均發現標記成藍黑色的HRP陽性顆粒)

討 論

何新澤等動物實驗發現大鼠腦損傷后損傷的坐骨神經的修復重建有明顯促進作用，但具體修復機制尚不清楚[25-29]。本文通過動物實驗比較顱腦損傷聯合應用他克莫司的坐骨神經損傷大鼠，損傷后的坐骨神經損傷恢復的情況。在所有的實驗觀測項目中，顱腦損傷聯合他克莫司(A1)組的坐骨神經修復效果要優于其他組，這也證實了顱腦損傷可以與他克莫司協同促進坐骨神經損傷后的修復，其作用機制與他克莫司不完全相同。

在Sunderland V型的外圍神經損傷后，神經損傷切斷了神經內分泌的養分，不能將其輸送到靶子器官上，靶子器官將失去活性和營養的支持[23-24]。根據目前的他克莫司促進神經機制，促進外圍神經修復相對明確是兩個功能領域，發揮神經營養功能，形成一個FKBP12的綜合體，加入功能地區后表達GAP-43，一個超蛋白質神經生長，并促進形成和擴大神經的生長由神經脈沖生成的生物電能，靶器官，再生軸突的內徑上升，厚厚的神經膜層，作用范圍增加[19-20]。這證實了他克莫司有助于恢復外圍神經的營養功能，萎縮身體的部分看起來更容易潰瘍，坐骨神經神經功能指數、濕重肌他克莫司組恢復較好，提示促進外形神經損傷的作用，結合功能或復雜的FKBP12 地區來促進表達GAP-43。

在外圍神經損傷后，軸突的退化立即發生，軸突碎片是由巨噬細胞吞噬清除的，新的軸突、未退化的神經元延伸到由Schwann細胞組成的內膜神經的間隙，靶器官逐漸建立聯系和營養[19]。靶子器官的恢復Masson染色、辣根過氧化物酶切片顯示，A1組免疫抑制效果優于 A2組/B1組/B2組，他克莫司結合FKBP12，形成鈣復合物抑制堿(CAN)，抑制T細胞的衰減，并抑制IL-2、IL-3的表達，以生產免疫抑制物[6]被神經接收。

周圍神經的損傷伴隨著血液神經屏障的破壞，刺激纖維增生和巨噬細胞的擴散，形成影響神經修復的疤痕[21-22]。他克莫司可以抑制纖維素的擴散、遷移和生物活性，抑制纖維素的擴散，并通過免疫抑制作用促進神經損傷的重建和修復。Masson 染色觀察到，A1組比A2組/B1組/B2組瘢痕減少；神經內分泌系統的調節，創造微型環境的因素、Schwann細胞的信號有助于促進軸突再生。神經交換的物質是軸漿的運輸器官[25]和再生軸芽器官通過內膜管再生作用于目標器官。軸突內物質更好地恢復運輸功能和靶器官的反饋是相互促進的[2]。辣根過氧化物酶染色證明A1組優于 A2組/B1組/B2組。免疫神經內分泌系統與腦損傷修復有密切的關系[26]，自主神經系統的中心結構被摧毀，導致免疫調節紊亂、改變或喪失，功能腦細胞的變性，導致Caspase瀑布反應性的激活，從而導致神經凋亡。

本試驗結果提示腦損傷伴隨周圍神經損傷動物早期應用他克莫司后，周圍神經修復再生方面較好，腦損傷、他克莫司均可促進周圍神經損傷的修復，并且協同促進神經損傷的修復效果更好，為腦損傷合并周圍神經損傷的患者提供了新的治療思路。但腦損傷促進周圍神經損傷的具體機制仍需進一步深入研究。