丹酚酸B對代謝記憶環境下RSC96細胞的保護作用*

王 蒙， 王倩倩， 孫連慶△

1.西安交通大學(西安 710049)；2.西安交通大學第一附屬醫院(西安 710061)

高血糖毒性是糖尿病周圍神經病變的獨立危險因素，控制血糖是目前治療糖尿病并發癥的主要手段，然而，大規模的臨床試驗顯示，對于病程較長或已經發生并發癥的糖尿病患者，即使以后將血糖控制在正常范圍并不能降低微血管并發癥的發生，這種現象稱之為“代謝記憶”[1-3]。研究發現：氧化應激在代謝記憶效應的產生中起主導作用。活性氧的大量累積可導致線粒體DNA損傷，誘發細胞凋亡及炎性損傷，進而導致糖尿病并發癥的持續發展[4-5]。

中醫上認為糖尿病并發癥是由于糖尿病長期存在，量變達到質變的過程，就會導致糖尿病并發癥的產生。奚九一認為消渴日久，傷及氣血津液，筋脈失養，這是糖尿病并發癥本虛的基礎。糖尿病后期多損及脾腎，脾腎失司，水谷精微不化且不運，不能布散于肢體筋脈，也不能蘊養五臟，就會產生風、痰、濕、瘀等邪氣，外邪入侵，內邪作亂，就會產生糖尿病并發癥或使其加重[6-7]。胡筱娟認為，糖尿病并發癥與體質、飲食、精神、吸煙等因素有關[8]。呂萍根據其多年臨床經驗認為脈絡閉塞、氣血瘀滯是糖尿病并發癥產生的關鍵[9]。

丹參中的化學成分有很多種，其中最有效且研究最熱的就是丹酚酸B，丹酚酸B是丹參的有效水溶性成分，具有清除自由基、抑制細胞凋亡、抗炎的作用。其可增加被高糖抑制的神經細胞的增值活性，減少氧化應激損傷，進而減少細胞凋亡[10]。然而在代謝記憶環境下，丹酚酸B是否能夠清除自由基，進而減少細胞凋亡呢？本研究在代謝記憶環境下，觀察丹酚酸B是否能夠下調ROS水平，降低凋亡及炎性相關蛋白的表達。

材料和方法

1 材 料

1.1 實驗細胞：大鼠雪旺細胞系細胞(Rat Schwann cell line)RSC96一種永生化的大鼠雪旺細胞，購自美國模式培養物集存庫ATCC(American type culture collection),由陜西藩勝生物科技有限公司上海辦代為采買。

1.2 藥品試劑：D-葡萄糖、丹酚酸B、低糖培養基、高糖培養基(Hyclone,美國)，活性氧(ROS)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司，中國)；兔抗大鼠Cleaved-caspase 9、Cleaved-caspase 3、P65、抗體(CST,美國)；IL-1β(Immunoway,中國)。

1.3 實驗儀器：CO2培養箱(上海普美達儀器有限公司，中國)；倒置相差顯微鏡(Olympus,日本)；臺式高速離心機(蘇州華宇凈化設備有限公司，中國)；酶標儀(BioTek,美國)；流式細胞儀(BD Biosciences公司，美國)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養及傳代：復蘇RSC 96細胞，加入DMEM培養基、胎牛血清(10%)、雙抗，2～3 d換液1次。待細胞長至瓶底80%～90%，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，3～5 d傳代一次，取對數生長期細胞進行此次實驗。

2.2 流式檢測ROS：按照5×104/孔的密度接種于6孔板，將實驗分為低糖組(5.6 mmol/L)，代謝記憶組(125 mmol/L高糖作用48 h，5.6 mmol/L低糖作用24 h)丹酚酸B組(125 mmol/L高糖+丹酚酸B 1 μmol/L作用48 h，5.6 mmol/L低糖+丹酚酸B1 μmol/L作用24 h)作用70 h，加入DCFH-DA 10 μmol/L作用2h，胰酶消化并收集細胞于流式機按照激發波長485 nm，發射波長525 nm進行檢測。

2.3 Western blot 檢測凋亡及凋亡相關蛋白的表達：加入不同條件作用72 h，各組細胞標本加入細胞裂解液提取蛋白，將含有40 μg蛋白上清液電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜上，并將含5%脫脂奶粉進行封閉，一抗(Cleaved-caspase 9、Cleaved-caspase 3、P65、IL-1β)過夜孵育，TBST洗膜3次，二抗孵育1 h，采用ECL試劑盒進行檢測，采用Image-pro圖像分析定量。

3 統計學方法 本實驗選用SPSS 18.0統計學軟件，所有數據均以平均值±標準差(Mean±SD)形式記錄，采用One Sample Kolmoglrov- Smirnov Z test檢測數據是否符合正態分布，兩組間比較采用t檢驗，多組獨立樣本比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，非正態分析數據采用非參數檢驗方法(K個獨立樣本的檢驗)。各種檢驗的顯著性水平均設定為α=0.05。

結 果

1 丹酚酸B降低ROS含量 流式檢測低糖組(5.6 mmol/L)、代謝記憶組(125 mmol/L高糖作用48 h，5.6 mmol/L低糖作用24 h)及丹酚酸B組(125 mmol/L高糖+丹酚酸B 1 μmol/L作用48 h，5.6 mmol/L低糖+丹酚酸B 1 μmol/L作用24 h)ROS含量，結果顯示如圖1。相較于對照組，代謝記憶組ROS含量明顯增加；相較于代謝記憶組，丹酚酸B組ROS含量明顯下降(P<0.05)，提示代謝記憶環境可激活氧化應激反應，丹酚酸B可抑制這一過程。

2 丹酚酸B降低RSC96細胞凋亡及炎性相關蛋白的表達 免疫印跡法檢測凋亡及炎性相關蛋白(Cleaved-caspase 9、Cleaved-caspase 3、P65、IL-1β)的表達，結果顯示如圖2。相較于對照組，代謝記憶組Cleaved-caspase 9、Cleaved-caspase 3、P65、IL-1β表達增加(P<0.05)；相較于代謝記憶組，丹酚酸B組Cleaved-caspase 9、Cleaved-caspase 3、P65、IL-1β表達水平下降(P<0.05)，提示代謝記憶環境可誘發RSC96細胞凋亡及炎性損傷，丹酚酸B可抑制這一過程的發生。

討 論

糖尿病周圍神經病變是最常見糖尿病慢性并發癥之一，隨著病程的延長，其發病率可高達90%以上[11]。目前，控制血糖是治療糖尿病及其并發癥的重要手段。最新研究發現：機體內存在高糖“代謝記憶”效應，因此，以控制血糖為重點的治療方法無法有效阻止糖尿病周圍神經病變的發生發展，如何正確認識并阻止“代謝記憶”效應成為目前防治糖尿病周圍神經病變的主要方向。

氧化應激是觸發細胞凋亡的重要發病機制。細胞凋亡，是多因素參與觸發細胞內預存的死亡程序而導致的細胞主動性死亡。研究發現：氧化應激所誘發的細胞凋亡是“代謝記憶”的重要發病機制。在高糖培養的原代臍靜脈內皮細胞中，細胞凋亡率明顯增加，當解除高糖后，細胞凋亡仍然持續，提示高糖是導致血管內皮細胞的重要因素，且內皮細胞受到高糖“代謝記憶”效應的持續影響[12]。不僅如此，研究發現：氧化應激所誘發炎性損傷是高糖“代謝記憶”效應的重要發病機制。在早期的異常糖代謝環境中，免疫炎癥可通過氧化應激直接損傷細胞，也可隨著病程的進展，其脂毒性、糖毒性和糖基化終產物的形成導致基因表達、細胞蛋白水平發生功能性和結構性的改變，最終引起糖尿病微血管并發癥的發生[13]。在這一過程中，白介素(Inter leukin,IL)家族、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、Toll 樣受體-4 (TLR4)、單核細胞趨化蛋白 1 (MCP-1)、核轉錄因子-κB(NF-κB)、轉化生長因子-β(TGF-β)等炎癥細胞因子及其引發的慢性炎癥免疫反應在糖尿病代謝記憶的發生發展中占有重要地位。

圖1 丹酚酸B減輕高糖代謝記憶對RSC96細胞的損傷(A：對照組；B：代謝記憶組；C：丹酚酸B組；D：三組之間統計學分析)

圖2 丹酚酸B減輕高糖代謝記憶誘導的細胞凋亡及炎性損傷(A：Cleaved-caspase 9蛋白統計學分析；B：Cleaved-caspase 3 蛋白統計學分析；C：P65蛋白統計學分析；D：IL-1β蛋白統計學分析)

Infante-Garcia C等[14]研究發現：在牛視網膜微血管內皮細胞(BREC)中，由高血糖誘導的NF-κB在血糖水平恢復正常后仍然升高，表明NF-κB影響相關的信號傳導途徑保持活化狀態，并導致細胞代謝記憶效應。Natarajan等[15]發現從9～11周雄性db/db小鼠分離出的血管平滑肌細胞，炎性基因、MCP-1、IL-1β處于高表達狀態，在血糖恢復8周后的，炎癥因子仍持續存在，說明高糖狀態被糾正的情況下，炎癥因子的持續存在與“代謝記憶”之間存在重要的聯系。Chan等[16]發現糖尿病鼠視網膜中炎性細胞因子IL-18、TNF-α，細胞黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)和誘導型氮氧化物合酶(iNOS)等促炎因子表達增加，而血糖恢復至正常水平后這些炎性因子并未降低。 Kowluru等[17]也觀察到高糖刺激可以引起視網膜周細胞中IL-1β、NF-κB、血管內皮生長因子(VEGF)、TNF-α和ICAM-1等炎癥因子的升高，且這些升高的炎癥因子并不能在血糖恢復正常后下調。

現代中醫理論認為糖尿病周圍神經病變是本虛標實之病[18-19]，最終導致DPN等糖尿病嚴重慢性并發癥的產生。而丹參的特性和功能完全可以與之對接，古代早已應用丹參治療下肢疾患，下肢軟弱無力、疼痛等癥狀，服用丹參后立見效果，癥狀全消，故古人稱之為“奔馬草”，服后猶如馬兒一樣能奔善跑。因此，丹參應用于糖尿病周圍神經病變的研究成為了相對較熱的中藥之一。而丹酚酸B作為丹參中的有效成分，根據文獻中記載，其可以用于DPN的治療，而丹參是通過哪種途徑來治療DPN的，目前還是在不斷發現當中。筆者通過查閱文獻認為，保護下肢末梢神經，促進末梢神經的神經內分泌的功能正常運行，是丹參治療DPN的一個重要途徑。因此，筆者做了實驗來證實這個猜測。

綜上認為，丹酚酸B可能通過抑制細胞凋亡及炎性損傷保護周圍神經細胞，但是現有研究僅在體外研究揭示高糖代謝記憶的發病機制。在今后的工作中可進一步通過在體研究印證丹酚酸B對糖尿病周圍神經病變的保護作用。