N-乙酰半胱氨酸腹腔注射對LPS誘導小鼠急性肺損傷的預防作用觀察

馮艷，王榮麗

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州 646000)

急性肺損傷(ALI)是多種因素引起的彌漫性肺實質損傷，也是全身炎癥反應綜合征或多器官功能障礙綜合征在肺部的典型表現，其特點是肺泡-毛細血管屏障損傷所造成的彌散性肺泡損傷及肺間質水腫，炎癥細胞浸潤及炎癥介質過量表達和釋放[1，2]。ALI的機制錯綜復雜，尚未完全闡明，但越來越多的證據表明多種信號通路及相關的蛋白可調節ALI的炎癥反應[3]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，普遍存在于真核細胞,高度進化保守，能夠被多種因素激活。JNK屬于MAPK家族成員之一，是一種應急激活的蛋白激酶(SAPK)，參與許多炎癥信號的轉導。N-乙酰半胱氨酸(NAC)作為祛痰藥廣泛應用于臨床,其是一種含有巰基的化合物，能裂斷痰液中黏蛋白的二硫鍵(SS)，將黏蛋白分解，降低痰的黏滯[4]。除此之外，NAC還有抗氧化、抗炎作用[5,6]。Mao等[7]發現NAC通過TLR-4 / NF-κB 信號通路減輕LPS誘導的急性肺損傷程度。張艱等[8]發現NAC對ALI的炎癥抑制可能是通過抑制p38MAPK的激活起作用。NAC能否通過JNK信號通路對LPS誘導的ALI發揮保護性調控，鮮見報道。2019年2～5月,本研究通過建立LPS誘導的ALI模型探討NAC對ALI的預防作用，并進一步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑、儀器 30只BALB/c 雌性小鼠，體質量19～23 g，購于重慶萊彼特生物科技有限公司，自由飲食、普通光照飼養于西南醫科大學動物實驗中心。動物實驗的開展取得了西南醫科大學實驗動物倫理委員會批準。NAC購于大連美侖生物公司；脂多糖購于Sigma；MPO檢測試劑盒購于南京建成生化試劑公司；小鼠血管細胞黏附分子(VCAM)ELISA試劑盒購于武漢科鹿生物科技公司；小鼠TNF-α ELISA 試劑盒購于武漢科鹿生物科技公司；Western blotting相關試劑購于武漢拜意爾生物科技有限公司；水合氯醛購于廈門海標科技有限公司。酶標儀購于Diatek公司；電泳儀及電泳槽購于北京市六一儀器廠；臺式離心機購于上海安亭科學儀器廠；冷凍離心機購于湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 NAC腹腔注射及小鼠ALI模型制作 30只BALB/c雌性小鼠，隨機分為5組：NAC 1、2、3組，模型組，對照組，各組分別為6只。參照文獻[9]鼻孔滴入10 μg LPS制作ALI模型。各組均以水合氯醛腹腔麻醉。對照組鼻孔滴入50 μL PBS，模型組小鼠鼻孔滴入LPS 10 μg (LPS溶于50 μL的PBS溶液中)。NAC 1、2、3組分別腹腔注射NAC 100、200、300 mg/kg，0.5 h后小鼠鼻孔滴入LPS 10 μg。各組小鼠于滴鼻處理后7 h被處死。頸椎脫臼法處死小鼠后，取出雙肺，右肺上葉測定肺干濕重比(W/D)，取左肺經4%甲醛液固定行病理組織學檢查，取右肺中葉檢測MPO、VCAM-1、TNF-α，取右肺下葉檢測pJNK蛋白。

1.3 小鼠肺組織病理變化觀察及肺W/D測算 采用HE染色觀察小鼠肺組織病理。小鼠左肺組織采用4%多聚甲醛進行固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，后進行HE染色，使用200倍光學顯微鏡下對小鼠肺組織病理學情況進行記錄。取小鼠右肺組織，將肺組織表面的水分和血液用濾紙吸干后稱W，置于70 ℃烘烤箱內烘干48 h至恒重，計算肺組織W/D。

1.4 小鼠肺組織MPO 、TNF-及VCAM-1檢測 取小鼠肺組織，使用勻漿器充分勻漿(冰上操作)，10 000 r/min離心10 min，收集離心后上清，即為肺臟組織勻漿液。采用ELISA方法，根據MPO試劑盒說明書的操作步驟測定勻漿液在480 nm處的吸光度值(OD值)，根據吸光度值計算不同肺臟組織的MPO活性。計算公式：MPO活性=(測定OD值-對照OD值)/11.3×取樣量(克)。采用ELISA法檢測肺組織勻漿中TNF-α、VCAM-1，用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度(OD 值)，通過標準曲線計算肺組織TNF-α、VCAM-1的濃度。

1.5 小鼠肺組織p-JNK蛋白檢測 采用Western blotting法。肺組織塊用PBS漂洗，制成勻漿，提取并測定蛋白濃度。配制SDS-PAGE 濃縮膠、SDS-PAGE分離膠，按濃縮膠80 V、分離膠120 V進行恒壓電泳。準備轉膜濾紙和PVDF膜，恒流轉膜。將轉好的膜加入封閉液，室溫封閉。除去封閉液，加入以下一抗：抗GAPDH 單克隆抗體，抗p-JNK抗體，過夜。然后將膜在室溫下與驢抗兔二抗一起溫育，隨后用TBST洗滌4次。滴加ECL混合溶液到膜的蛋白面側，暗室中曝光。膠片進行掃描存檔，使用 GAPDH 作為參考，AlphaEaseFC軟件處理系統分析目標帶OD值。

2 結果

2.1 肺組織大體病理表現及肺W/D 對照組肺組織結構清晰，肺泡間隔無增寬，可見少量炎性細浸潤。模型組肺組織損傷嚴重，肺泡間隔增寬，肺組織間質及肺泡腔可見大量炎細胞浸潤；NAC預處理的各組肺組織相對模型組隨劑量增加損傷程度減輕；NAC3組光鏡下可見肺泡壁多數完整，肺泡隔較模型組明顯變窄，肺組織炎性細胞浸潤明顯減少。NAC 1、2、3組，模型組，對照組肺W/D分別為7.20±0.49、6.04±0.62、5.02±0.42、7.93±0.69、4.36±0.20。與對照組相比，模型組肺組織W/D升高(P<0.001)；與模型組相比，NAC 1 、2、3組肺W/D降低(P均<0.05)，且NAC1、2、3組之間兩兩比較，P均<0.05。

2.2 各組肺組織MPO活性、TNF-α含量 、VCAM-1含量及p-JNK蛋白表達比較 與對照組相比，模型組肺組織MPO活性，TNF-α、VCAM-1含量，p-JNK蛋白相對表達量升高(P<0.001)；與模型組相比，NAC 1 、2、3組肺組織MPO活性，TNF-α、VCAM-1含量，p-JNK蛋白相對表達量降低(P均<0.05)，NAC 1、2、3組肺組織MPO活性、TNF-α含量、p-JNK蛋白相對表達量之間兩兩比較，P均<0.05。NAC 各組VCAM-1含量兩兩比較：NAC 1組與3組、2與3組之間比較，P均<0.05；NAC1、2組之間比較，P>0.05。見表1。

表1 各組肺組織MPO活性，TNF-α、VCAM-1含量及p-JNK蛋白相對表達量

3 討論

ALI是由嚴重感染、創傷、休克、中毒、吸入性有害氣體、急性胰腺炎等引起的急性進行性呼吸衰竭[9，10]。其病理生理機制表現為肺泡-毛細血管屏障損傷、炎癥、氧化損傷和肺泡細胞凋亡[2]。在 ALI 炎癥過程中，炎癥細胞在肺內大量積聚浸潤，炎癥介質過度釋放、活化和抗炎因子相對減少，引發體內炎癥反應失衡。此外，炎性細胞因子和趨化因子可以募集中性粒細胞和其他炎性細胞，以進一步釋放促進肺部炎癥的炎性因子和細胞因子，導致 ALI 的發展。目前ALI的治療干預措施，如低潮氣量通氣或俯臥位，主要是支持或旨在通過機械通氣避免額外的肺損傷[11]。然而，機械通氣不能夠逆轉ALI患者病情，且由于ALI患者肺臟病變不均一，仍有部分患者會出現呼吸機相關肺損傷，進而使得病情惡化[12]。NAC是一種具有抗炎特性的含硫醇抗氧化劑[6]。本研究采用LPS滴鼻建立ALI動物模型。研究結果發現，NAC預處理能夠減輕LPS誘導的ALI，降低了W/D、MPO活性，抑制了炎性細胞因子TNF-α、黏附分子VCAM-1的分泌以及JNK的磷酸化。NAC預處理能夠減輕LPS誘導的ALI肺組織病理損傷，表明NAC對ALI產生了有效的保護作用。

肺泡屏障功能的破壞，導致對水、蛋白質和其他溶質的滲透性增加，是臨床和實驗性 ALI 的標志[13]。在動物研究[14]中，肺血管通透性可以根據肺組織樣品的W/D來評估。本研究結果發現，NAC能夠顯著降低W/D，且呈劑量依賴性降低，表明NAC可改善肺微血管通透性，抑制漿液向肺組織的滲漏。

白細胞浸潤，特別是中性粒細胞浸潤是LPS 損傷后的肺部炎癥的特征[15]。中性粒細胞激活后從脈管系統遷移到肺泡腔內，導致炎性細胞因子水平升高，促進肺損傷的發展和持續[16]。MPO是中性粒細胞粒細胞中的一種豐富的酶，可產生次氯酸，用于殺死入侵的細菌，因此，MPO活性反映了中性粒細胞的浸潤數目和活性[17]。本研究結果發現NAC可顯著降低MPO活性，表明NAC可抑制中性粒細胞浸潤，改善小鼠肺損傷程度。TNF-是ALI早期階段的生物標志物，可引發炎癥級聯反應，引起血管內皮細胞損傷，并誘導肺泡上皮細胞產生其他細胞因子，如IL-6[18]。實驗中，NAC干預可使肺組織中TNF-α分泌水平明顯降低，呈劑量依賴性降低，表明NAC顯著抑制TNF-α的分泌，來改善ALI小鼠的炎癥反應。中性粒細胞向發炎肺部的遷移是由多種因素介導的，其中細胞黏附分子和趨化因子被認為是最重要的因素[19]。外周血中性粒細胞通過VCAM-1透過肺泡毛細血管屏障募集到發炎的肺組織中[20]。VCAM-1主要由血管內皮細胞表達。正常生理條件下，肺血管內皮細胞不表達或者僅少量表達VCAM-1，內毒素、促炎因子等刺激致黏附分子大量表達[21]。經NAC干預后，VCAM-1的表達顯著降低，并呈劑量依賴性降低，表明NAC可以降低黏附分子的表達，減輕VCAM-1所介導的中性粒細胞在肺組織中的募集和錨定，從而減輕ALI。

MAPK家族的成員主要包括JNK，細胞外信號調節激酶(ERK)和p38MAPK。MAPK信號轉導通路高度進化保守，能夠對不同的刺激做出協調和整合，調控著細胞的生長繁殖、分化、成熟、凋亡等過程，也是細胞內觸發炎性反應的主要通路。JNK一旦被激活則成為p-JNK，其包含雙磷酸化的功能區與c-Jun N端的活化區結合，使其第63、73位絲氨酸殘基磷酸化。c-Jun是轉錄因子活化蛋白1(AP-1)的組成部分，而活化的AP-1是與應激和炎癥有關基因的關鍵反式激活劑。本研究結果發現，LPS誘導ALI小鼠的肺組織中JNK磷酸化明顯增強，肺組織炎癥介質升高，且模型組的p-JNK表達量最大，肺組織炎癥介質含量最高，提示JNK信號通路參與了LPS誘導的ALI炎癥反應。為了明確NAC對LPS誘導ALI的保護性作用是否是通過JNK信號通路來實現的，我們給予3種不同劑量NAC預處理ALI大鼠，結果發現NAC預處理組p-JNK蛋白表達均有不同程度的減少，且呈劑量依賴性方式降低，表明NAC能夠抑制JNK的磷酸化。JNK生物學活性是在其磷酸化狀態下實現的，NAC可能通過抑制p-JNK表達在一定程度上抑制LPS誘導的ALI炎癥反應。

綜上所述， NAC能夠通過減輕ALI小鼠肺水腫，中性粒細胞浸潤及TNF-α、VCAM-1的表達發揮有效保護作用；NAC能夠抑制LPS誘導的ALI小鼠JNK信號通路的激活。NAC可能通過抑制JNK信號通路對LPS誘導的ALI發揮保護性作用。