類風濕關節炎患者血清長鏈非編碼RNA-Hox轉錄反義RNA表達變化及其意義

鐵寧,王勇,滿大夫,于洋

(內蒙古醫科大學附屬醫院,呼和浩特010059)

類風濕關節炎(RA)是一種自身免疫介導的慢性炎癥性疾病，病理上主要表現為滑膜炎、血管翳，造成全身性關節滑膜、關節軟骨和骨質破壞，可引起患者關節畸形和功能喪失[1]。研究[2]表明，非蛋白編碼RNA參與廣泛的生物學和病理學過程，如細胞增殖、凋亡、炎癥和自身免疫過程。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的RNA調控分子，研究[3]表明，LncRNA在腫瘤、慢性炎癥及自身免疫性疾病等疾病中均存在異常表達的現象，有可能成為疾病診斷及治療的生物學靶點。Chang等在2007年首次發現一種新的LncRNA即Hox轉錄反義RNA(HOTAIR)，長度約2.2 kb，位于人類染色體12q13.13上，在惡性腫瘤、RA及帕金森病等多種疾病的發生發展中起調節作用[4],但目前有關LncRNA-HOTAIR在RA中的表達變化及意義方面的研究較少。本研究觀察了LncRNA-HOTAIR在RA患者血清中的表達變化，分析其與患者臨床參數的關系，并探討了其診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年1月～2018年12月內蒙古醫科大學附屬醫院收治RA患者132例(RA組)，均符合2010年美國風濕病協會/歐洲抗風濕病聯盟的RA診斷標準[5]。納入標準：年齡均>18歲；28個關節疾病活動指數(DAS28)[6]>2.6；患者及家屬對本研究知情同意并簽字。排除標準：外傷、感染等因素導致的關節腫痛；合并系統紅斑狼瘡等其他自身免疫性疾病；合并心肝肺腎等重要臟器功能不全。其中男29例、女103例，年齡21～73(51.1±10.7)歲，病程2～36(23±7.8)個月；疼痛關節數<5個60例、>5個72例，腫脹關節數≤6個56例、>6個76例；病情低度活動(DAS28>2.6～3.2)36例，病情中度活動(DAS28 3.2～5.1)37例，病情高度活動(DAS28>5.1)59例。以50例同期體檢健康者作為對照組，男11例、女39例，年齡21～78(49.7±9.4)歲，患者均無自身免疫性疾病史。兩組性別、年齡有可比性。

1.2 血清LncRNA-HOTAIR的檢測 采用 qRT-PCR法。取研究對象(RA組入院第二天,對照組入院當天)清晨空腹靜脈血3 mL，置于枸櫞酸鈉抗凝管中，3 000 r/min，4 ℃離心10 min，后取上清液，-80 ℃冰箱保存待測。應用TRIzol法提取血清中總RNA，提取步驟嚴格按照血清RNA提取試劑盒說明書(Qiagen公司)進行。以總RNA為模板，用反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)進行反轉錄，合成cDNA，紫外分光光度計鑒定cDNA濃度及純度，-20 ℃冰箱保存。應用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒、qRT-PCR檢測LncRNA-HOTAIR。LncRNA-HOTAIR：上游引物序列:5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游引物序列：5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′，內參基因GAPDH上游引物序列:5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物序列:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。總反應體系20 μL，上下游引物各1 μL，模板4 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 2 μL，DEPC水補足體系20 μL。qRT-PCR反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。反應均在ABI7900實時定量PCR儀上完成，每個樣本重復3次。各組LncRNA-HOTAIR基因的循環閾值(CT)減GAPDH的CT值為ΔCt值，用2-ΔΔCt表示LncRNA-HOTAIR基因的相對表達量。

1.3 血清抗環瓜氨酸肽(CCP)抗體、類風濕因子(RF)、CRP、ESR的檢測 取研究對象(RA組入院第二天,對照組入院當天)清晨空腹靜脈血,采用ELISA試劑盒檢測CCP抗體，結果>15 U/mL為陽性，試劑盒購自德國歐蒙公司，檢測儀器為全自動酶標儀。采用速率散射比濁法檢測RF、CRP，RF>20 U/mL為陽性，CRP>8 mg/L為陽性，試劑盒購自上海川翔生物公司，應用日立7600全自動生化分析儀檢測，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。采用魏氏法檢測ESR，結果>15 mm/h為陽性。

2 結果

2.1 各組血清LncRNA-HOTAIR水平及其他炎性指標比較 RA組 LncRNA-HOTAIR、抗CCP抗體、RF、 CRP、ESR水平分別為2.021±0.312、(211.5±132.6)U/mL、(39.2±5.3)U/mL、(13.16±4.7)mg/L、(21.2±4.6)mm/h，對照組分別為1.551±0.202、(10.1±2.1) U/mL、(8.1±3.6)U/mL、(3.1±0.7)mg/L、(8.2±3.2)mm/h。兩組上述指標比較，t分別為11.924、17.445、45.268、23.902、21.515，P均<0.01。

2.2 RA組血清LncRNA-HOTAIR水平與患者臨床參數的關系 RA組病情高度活動者血清LncRNA-HOTAIR的相對表達量高于中度及低度活動者(P<0.05)，而中度與低度活動者比較，P>0.05；RA組患者血清LncRNA-HOTAIR水平與DAS28呈正相關(r=0.645，P=0.009)。血清LncRNA-HOTAIR水平與RA患者性別、年齡、病程、疼痛關節數、腫脹關節數、RF、CRP、ESR及抗CCP抗體無相關性(P均>0.05)。見表1。

2.3 血清LncRNA-HOTAIR水平對RA的診斷價值血清LncRNA-HOTAIR水平診斷RA的ROC AUC為0.706(95%CI：0.573～0.839，P=0.004)，最佳診斷界值為1.819時，靈敏度、特異度、準確度分別為0.71、0.82、0.78；詳見圖1。

表1 血清LncRNA-HOTAIR水平與RA患者臨床參數的關系

圖1 血清LncRNA-HOTAIR水平診斷RA的ROC

3 討論

RA是慢性、特發性的自身免疫性疾病，特征為多關節滑膜炎，關節軟骨退化及邊緣骨質侵蝕，并引起關節腫脹、疼痛、功能喪失和僵硬，嚴重影響患者的健康和生活質量。有研究[7]顯示LncRNAs可通過多種機制調節基因表達，如表觀遺傳學修飾、選擇性剪接，小RNA分子海綿以及轉錄和翻譯調節。LncRNA可通過調控核因子-κB和Toll樣受體信號傳導通路的信號傳導參與調節細胞因子表達、免疫細胞的增殖和分化及炎癥過程，在多發性硬化癥、系統性紅斑狼瘡、I型糖尿病和RA等多種自身免疫性疾病中發揮重要的調控作用[8]。

HOTAIR是長約2.2 kb的LncRNA，由RNA聚合酶II經轉錄、剪接、多腺苷酸化和5′-端加帽等過程合成。人類HOTAIR由6個外顯子組成，也存在于其他哺乳動物如小鼠和大鼠中。有研究表明LncRNA-HOTAIR能夠通過反式作用調節基因表達，如LncRNA-HOTAIR與PRC2(含有H3K27甲基化酶EZH2和其他亞基)相互作用并作用于HOXD基因，導致H3K27-三甲基化和HOXD基因表達沉默，而在siRNA敲除LncRNA-HOTAIR基因表達后，HOXD基因H3K27-三甲基化標記喪失[9]。近年有研究[10]表明，RA局部微環境中巨噬細胞、樹突狀細胞等炎性細胞LncRNA-HOTAIR表達上調，LncRNA與信使RNA相比更為穩定，可進入RA局部炎癥微環境及外周血中，促進破骨細胞及滑膜細胞中MMP-2和MMP-13的表達，促進骨和軟骨基質的溶解，導致關節破壞，最終促進RA的發展。因此研究HOTAIR在RA患者血清中的表達可能具有重要的臨床意義。

目前臨床上診斷RA主要依賴患者臨床表現、影像學檢查及血清學檢查，特別是血清學指標檢查在RA的診斷中具有重要的臨床意義。RF在RA的診斷中應用較早，但在系統性紅斑狼瘡、腫瘤中可能存在假陽性，因而單獨依賴RF診斷容易造成誤診或漏診。RA是一種慢性炎癥性疾病，ESR和CRP是臨床上反映炎癥活動程度的重要檢查指標，雖然有助于反映RA炎癥感染的狀態，但診斷RA的特異性不高?？笴CP抗體是環狀聚絲蛋白多肽片段，以IgG型為主，其診斷RA的敏感性與RF相似，但特異性較RF高，有助于RA的早期診斷和病情判斷。本研究中，RA組患者血清LncRNA-HOTAIR、RF、CRP、ESR及抗CCP抗體明顯高于對照組，表明檢測血清LncRNA-HOTAIR、RF、CRP、ESR及抗CCP抗體均有助于RA疾病的診斷。RA患者血清LncRNA-HOTAIR水平升高，其原因可能是在脂多糖等因素作用下局部微環境處于炎癥狀態，局部免疫細胞如巨噬細胞、CD4+T細胞等能產生IL-17、IL-23、TNF-α等促炎性細胞因子，一方面能促進關節滑膜細胞內NF-κB信號通路活化，誘導MMPs等基因的表達，導致關節破壞，另一方面，促炎性細胞因子招募循環血中單核細胞向關節內遷移，而單核細胞中LncRNA-HOTAIR的表達較高，釋放入血后引起血清LncRNA-HOTAIR水平升高[11]。DAS28是評估RA疾病活動性的綜合指標，其內容包括關節疼痛和腫脹數、實驗室指標ESR及患者健康狀況，是目前監測RA疾病活動性及治療有效性良好指標。本研究中，RA組病情高度活動者血清LncRNA-HOTAIR的相對表達量高于中度及低度活動者，血清LncRNA-HOTAIR水平與DAS28呈正相關，表明檢測RA患者血清LncRNA-HOTAIR有助于疾病活動性判斷，血清LncRNA-HOTAIR有可能作為RA早期診斷和判斷活動性的分子標志物。本研究進一步應用ROC分析血清LncRNA-HOTAIR水平對RA的診斷價值，結果顯示血清LncRNA-HOTAIR診斷RA的ROC AUC為0.706，敏感度為71%，特異度為82%，表明血清LncRNA-HOTAIR水平對RA診斷具有較高的敏感度和特異度，有可能成為新的RA診斷生物標志物。LncRNA-HOTAIR不容易被RNA酶降解，性質穩定，應用普通PCR即可檢測，因而敏感性較高。研究[12，13]表明，對RA患者應用兩種不同的生物制劑(Tocilizumab和Adalimumab)治療后，LncRNA芯片結果中差異表達的LncRNA無重疊，表明不同生物制劑治療后可通過影響特定的LncRNA發揮治療作用。

綜上所述，RA患者血清LncRNA-HOTAIR水平升高，其表達水平與疾病活動程度有關。檢測血清LncRNA-HOTAIR的水平對于診斷RA具有較高的敏感性和特異性。RA患者血清LncRNA-HOTAIR有可能成為潛在的RA診斷和治療靶點，但目前LncRNA-HOTAIR在RA發生發展機制中的調控作用尚不清楚，有待進一步深入研究。