肺癌組織中Livin、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化因子3基因的表達(dá)觀察

王曉月，葛愛，林勇

(1南京市胸科醫(yī)院，南京 210029;2上海市肺科醫(yī)院)

肺癌發(fā)生于支氣管黏膜上皮，在臨床上也稱之為支氣管肺癌，隨著工業(yè)發(fā)展的不斷進(jìn)步，肺癌的發(fā)病率和病死率也逐年攀升[1]。在我國的絕大部分地區(qū)，肺癌的病死率居惡性腫瘤首位[2]。目前肺癌的治療主要以手術(shù)治療、放化療、免疫治療和中醫(yī)治療為主，治療方式的進(jìn)步極大改善了肺癌患者的預(yù)后和生存[3]，但仍有部分患者療效不佳。肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中涉及到一系列基因和蛋白的變化，尋找到與肺癌密切相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，也許可以將其用于肺癌患者的靶向治療[4]。

Livin屬于凋亡蛋白抑制因子家族成員，能夠抑制細(xì)胞凋亡，其在正常組織中低表達(dá)，而在乳腺癌、腸癌和胃癌等腫瘤組織中高表達(dá)[5]。研究[6]報道顯示，Livin與黑色素瘤、胃癌和乳腺癌等腫瘤的轉(zhuǎn)移和分化相關(guān)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)是一種DNA結(jié)合蛋白，能夠被Jauns激酶(JAK)磷酸化激活，激活后的STAT3進(jìn)入細(xì)胞核并結(jié)合到基因的啟動子上調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄[7]。腫瘤轉(zhuǎn)移和分化過程中多種癌基因被激活，可見STAT3轉(zhuǎn)錄激活癌基因與腫瘤轉(zhuǎn)移和分化密切相關(guān)。研究[8]報道顯示，在乳腺癌和胃癌中STAT3能夠調(diào)控Livin基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。目前，STAT3和Livin在肺癌中的表達(dá)情況及二者之間的關(guān)系仍不清楚，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。為此，本研究觀察了86例肺癌患者癌組織中Livin和STAT3基因的表達(dá)變化，并探討了二者與肺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年8月～2018年10月南京市胸科醫(yī)院收治的肺癌患者86例，男45例、女41例，年齡42～75(56.36±10.74)歲，肺腺癌52例、鱗癌34例，有吸煙史21例、無吸煙史65例，TNM分期[9]Ⅰ期32例、Ⅱ期22例、Ⅲ期18例、Ⅳ期14例，分化程度為低分化57例、中分化17例、高分化12例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例、未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例，肺癌組織直徑在5 cm以下53例、5 cm以上33例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)診斷確診為肺癌者；②與院方簽署知情同意書者；③臨床資料完整，并且隨訪資料完善者；④患者在入院之前未接受過放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝腎功能異常者；②確診為肺癌，但是合并有其他類型腫瘤者；③患者為孕婦或者處于哺乳期；④存在精神障礙，對治療的依從性較差者。

1.2 肺癌及癌旁組織中Livin mRNA、STAT3 mRNA檢測 手術(shù)切除肺癌組織以及距離肺癌組織3 cm以上的癌旁組織后將其置于凍存管中，液氮速凍之后置于-80 ℃冰箱保存。待需要檢測時，將組織從-80 ℃冰箱取出并置于液氮速凍，使用研缽將腫瘤組織研磨成粉末，根據(jù)腫瘤組織的大小加入適量的TRIzol提取液，使用移液槍充分吹打混勻，冰上裂解30 min后加入苯酚-氯仿-異戊醇抽提液抽提腫瘤組織中的RNA，抽提結(jié)束后用乙醇將RNA沉淀，3 000 g離心10 min后棄去上清液，待乙醇蒸發(fā)完全后加入無菌水進(jìn)行溶解，獲得RNA溶液。隨后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國賽默飛世爾生物科技有限公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)驗操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。獲得cDNA文庫后使用熒光定量PCR儀(美國安捷倫科技有限公司，型號Mx3000PS)、實(shí)時熒光定量PCR試劑盒(美國賽默飛世爾生物科技有限公司)對Livin和STAT3的表達(dá)進(jìn)行檢測，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書和儀器說明書進(jìn)行。Livin的PCR引物序列：正向引物：5′-TGGTCCGGCGCATGGCTGCT-3′，反向引物：5′-TTGGGTGCCAGCAAGAAGG-3′。STAT3的PCR引物序列：正向引物：5′-AGCTCAAGGGGCCGCATCG-3′，反向引物：5′-TCGAGGGCACCTTCCTGAT-3′。GAPDH的PCR引物序列：正向引物：5′-TCTCTCAGATGTAACTGAGCTG-3′，反向引物：5′-TAGCTCATCAACCGATCT-3′。在檢測Livin和STAT3表達(dá)量的同時，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，并檢測其表達(dá)量。反應(yīng)體系共 20 μL，13 μL SYBR Green Premix，上游和下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O離子水3 μL。反應(yīng)條件：96 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃ 變性40 s，60 ℃ 退火60 s，70 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。通過相對ΔCt值法對Livin和STAT3相對表達(dá)量進(jìn)行計算，目的基因Livin和STAT3的相對表達(dá)量以2-ΔΔCt表示，其中ΔCt目的基因=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt目的基因=ΔCt目的基因-Ct陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 肺癌及其癌旁組織中Livin mRNA、STAT3 mRNA相對表達(dá)量比較 肺癌組織中Livin mRNA、STAT3 mRNA相對表達(dá)量分別為10.24±2.35、8.23±2.27，癌旁組織Livin mRNA、STAT3 mRNA的相對表達(dá)量分別為2.39±0.41、1.08±0.23，兩組比較，t分別為30.517、29.061，P均<0.01。

2.2 肺癌組織中Livin mRNA、STAT3 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系 肺癌組織中Livin mRNA、STAT3 mRNA表達(dá)與患者腫瘤組織的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期相關(guān)(P均<0.05)，與患者的年齡、性別、吸煙史、肺癌的病理分型和腫瘤體積大小無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 肺癌組織Livin mRNA、STAT3 mRNA表達(dá) 與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 肺癌組織中Livin mRNA、STAT3 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 肺癌組織中Livin mRNA與STAT3 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.607，P=0.011)。

3 討論

肺癌的發(fā)病與遺傳和環(huán)境因素密切相關(guān)。研究[10]報道顯示，攜帶肺癌易感基因的人群肺癌發(fā)生率明顯高于正常人群，而吸煙和塵肺也是肺癌發(fā)生的影響因素。肺癌的早期癥狀不明顯，臨床上容易產(chǎn)生誤診和漏診，大部分患者在確診肺癌時已經(jīng)處于肺癌晚期[11]。肺癌發(fā)病是多基因綜合作用的結(jié)果，涉及到的基因數(shù)量龐大，并且肺癌的發(fā)病過程分為多個階段，各個階段發(fā)揮作用的基因類群迥異，因此肺癌的發(fā)病分子機(jī)制極為復(fù)雜。目前對肺癌發(fā)病的分子機(jī)制仍然缺乏了解，已有的腫瘤干細(xì)胞假說、化學(xué)致癌假說、肺細(xì)胞DNA損傷致癌假說、肺癌物理因子致癌假說和腫瘤免疫逃逸假說均只能部分解釋肺癌的發(fā)病過程，因此迫切需要對肺癌發(fā)病的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，從中尋找可以用于肺癌早期診斷和治療的分子標(biāo)志。

Livin蛋白是一種抗凋亡蛋白，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體對Livin蛋白進(jìn)行糖基化修飾，研究報道顯示，Livin蛋白的糖基化修飾對于Livin蛋白的抗凋亡作用十分重要。在乳腺癌、卵巢癌和胃癌中均能夠觀察到Livin的高表達(dá)，在多種腫瘤中Livin主要作為癌基因發(fā)揮作用[11]。Livin蛋白通過抑制Caspase途徑和激活JNK來抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[10]。研究[12]報道顯示，Livin能夠激活細(xì)胞內(nèi)的生存素信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞的分化和轉(zhuǎn)移。STAT3蛋白是JAK-STAT3信號通路中的關(guān)鍵蛋白分子，STAT3在未被激活的情況下主要位于細(xì)胞質(zhì)中，并以單體的形式存在。經(jīng)JAK磷酸化修飾后，兩個STAT3單體相互作用并形成相應(yīng)二聚體，通過蛋白結(jié)構(gòu)上的核定位信號進(jìn)入細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。研究[13]顯示，STAT3作為轉(zhuǎn)錄因子能夠激活一系列癌基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，肺癌患者癌組織中Livin、STAT3表達(dá)均高于對應(yīng)的癌旁組織，表明在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能有Livin和STAT3的參與。研究報道顯示，STAT3的表達(dá)上調(diào)與肺癌細(xì)胞膜上的JAK受體蛋白的活化密切相關(guān)，JAK受體蛋白的活化會導(dǎo)致下游一系列蛋白的磷酸化活化，進(jìn)而激活STAT3[14]。肺癌中Livin表達(dá)上調(diào)的機(jī)制仍不明確，已有研究[15]報道顯示，Livin表達(dá)上調(diào)與死亡受體信號通路的激活相關(guān)。

研究[16]表明，Livin能夠與細(xì)胞命運(yùn)決定因子等肺癌分化相關(guān)蛋白相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)肺癌的分化和轉(zhuǎn)移。STAT3的表達(dá)上調(diào)能夠激活有絲分裂原激活的蛋白激酶信號通路，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中Livin和STAT3表達(dá)與腫瘤組織的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期相關(guān)。表明Livin和STAT3表達(dá)參與肺癌的增殖及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)過程。本研究還發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中Livin和STAT3的表達(dá)呈正相關(guān)?？赡苁且驗楫?dāng)STAT3被JAK磷酸化激活后進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的STAT3能夠結(jié)合一系列基因的啟動子、并激活癌基因的轉(zhuǎn)錄，而Livin基因在多種腫瘤中均顯示是一種癌基因，因此STAT3能夠結(jié)合到Livin基因的啟動子區(qū)域并激活其轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Livin表達(dá)水平升高[18]。但是對STAT3調(diào)節(jié)Livin表達(dá)的分子機(jī)制仍然需要更進(jìn)一步實(shí)驗進(jìn)行驗證。

綜上所述，肺癌組織中Livin和STAT3 mRNA表達(dá)上調(diào)，與腫瘤組織的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期密切相關(guān)，二者可能可以作為肺癌診斷、治療效果和預(yù)后評估的分子標(biāo)志，具體能否應(yīng)用于臨床需要進(jìn)一步研究明確。