Hsp90抑制劑WH-4對肝癌細胞株SK-HEP-1增殖、凋亡及耐藥基因表達的影響觀察

徐單單，王穎，陳素紅

(1廣東食品藥品職業學院生物技術學院，廣州510520；2暨南大學生命科學技術學院；3仲愷農業工程學院食品學院)

肝癌是世界第五大常見腫瘤疾病[1],盡管現代醫學取得巨大進步，但是其預后仍較差,5年生存率較低。肝癌的復發、轉移與耐藥是患者5年生存率降低的主要原因，大約有70%的肝癌患者在治療5年后會復發[2]?；熓歉伟┲委煹闹饕侄巍orafenib是一種多酶抑制劑靶點藥物，為常見的肝癌治療一線藥物,主要用于不能進行手術治療的肝癌患者[3]，但是Sorafenib使用后患者會出現明顯的耐藥或因其不良反應如高血壓、惡心、皮膚病以及腹瀉等[4]而停藥，這些缺點限制了Sorafenib的臨床應用。其他肝癌化療藥物，如Regorafenib、Ramucirumab臨床效果均不及Sorafenib[5]。所以，研究及開發其他靶點的肝癌治療藥物成為必需。

本課題組之前已深入研究過Hsp90抑制劑SNX-2112，發現其能抑制黑色素瘤、肝癌、乳腺癌細胞的增殖[6～9]，但是其水溶性不好。2008年1月至今，本研究在前期研究的基礎上，觀察了SNX-2112的衍生物WH-4對肝癌細胞SK-HEP-1增殖、凋亡和化療藥物耐藥基因ABCB1、ABCG2的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 肝癌細胞株SK-HEP-1購自中山大學細胞庫，采用1640培養基(10%胎牛血清，1%青霉素鏈霉素)，置于37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養。WH-4由暨南大學王一飛教授實驗室合成。17-AAG購自上海藍木生物公司，MTT粉末購自碧云天生物技術公司，1640培養基購自Gibco公司，胎牛血清購自四季青公司，青霉素鏈霉素購自廣州天駿公司，AnnexinV-APC/7AAD細胞凋亡試劑盒購自南京凱基公司。Bcl2(#4223)抗體、Bcl-xL(#2764)以及Bax(#2774)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。ECL細胞Western blotting發光液購自美國Millipore公司。細胞培養箱購自美國Thermo公司，流式細胞儀購自美國BD公司，PCR儀器購自BIO-RAD公司。

1.2 不同濃度WH-4對肝癌細胞SK-HEP-1增殖的影響觀察 ①采用MTT法。將肝癌細胞SK-HEP-1隨機分為A、B、C組，每組肝癌細胞SK-HEP-1經胰酶消化后，接種到96孔板，每孔接種5 000個細胞，每組設3個復孔，A組分別加入0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L WH-4，B組分別加入0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L 17-AAG， C組加等量的生理鹽水。1640培養基培養24 h、48 h，酶標儀檢測450 nm OD值，計算細胞存活率：細胞存活率(%)=實驗組OD /對照組OD ×100%(實驗組指A組、B組，對照組指C組)②采用BrdU法。將肝癌細胞SK-HEP-1隨機分為A1、B1、C1組，分別加入2.3 μmol/L WH-4、2.6 μmol/L 17-AAG組及等量的生理鹽水，1640培養基培養48 h，1 500 r/ min離心5 min離心收集收集各組肝癌細胞，按試劑盒說明書操作，最后熒光顯微鏡觀察細胞增殖情況( 藥物對細胞有抑制效果，綠色熒光變弱；反之，變強)。③克隆形成率的測算：采用軟瓊脂平板實驗。將肝癌細胞SK-HEP-1隨機分為A2、B2、C2組，分別加入2.25 μmol/L WH-4、2.80 μmol/L 17-AAG及等量生理鹽水，用含20%胎牛血清的1640培養基(2倍雙抗)將各組肝癌細胞SK-HEP-1調整至密度30 000個/mL，按試劑盒說明書操作。顯微鏡下觀察大于50個細胞的結晶紫染色克隆。細胞克隆形成率 = 大于50個細胞的克隆數 / 接種細胞數 × 100%。

1.3 WH-4對肝癌細胞SK-HEP -1凋亡的影響觀察 采用流式細胞術。實驗分組及處理同克隆能力觀察試驗。1640培養基培養各組肝癌細胞SK-HEP-1 48 h，棄去培養基上清，胰酶消化細胞，用PBS洗滌細胞3次，收集5×105個細胞；每個樣品加入500 μL結合液重懸細胞，錫箔紙包好靜置15 min；然后每個樣品再加入5 μL的Annexin-APC凋亡試劑，輕輕混勻后靜置5 min，再加5 μL的7-AAD凋亡試劑，混勻；室溫下避光孵育15～20 min，流式細胞儀測算細胞凋亡率。

1.4 WH-4對肝癌細胞SK-HEP-1凋亡蛋白Bcl2、Bax、Bcl-xL的影響觀察 采用Western blotting法。實驗分組及處理同同克隆能力觀察試驗。1640培養基培養48 h，1 500 r/min離心5 min離心收集各組肝癌細胞SK-HEP-1，細胞用含苯甲基磺酰氟(PMSF)的 RIPA 裂解液裂解，金屬浴加熱裂解細胞到完全溶解。然后使用BCA法測定蛋白濃度，并使用SDS loading buffer上樣緩沖液稀釋細胞。蛋白樣品使用12%的SDS-PAGE 凝膠電泳分離，然后轉膜到PVDF膜上。5%脫脂牛奶(0.1%吐溫20，TBS緩沖液)室溫封閉 1.5 h，TBST緩沖液洗滌膜3次后，一抗與PVDF 膜4 ℃ 雜交孵育過夜。次日，TBST洗滌PVDF膜3次，然后加入相應的二抗，室溫1 h，利用化學發光法顯影蛋白表達水平。使用GAPDH作為內參蛋白。

1.5 WH-4對多藥耐藥基因 ABCB1、乳腺癌耐藥蛋白(ABCG2)的影響觀察 采用qPCR法。將肝癌細胞SK-HEP-1隨機分為A3、B3、C3組，分別加入2.30 μmol/L WH-4、2.65 μmol/L 17-AAG及等量生理鹽水。1 500 r/ min離心收集上述濃度藥物作用48 h后的細胞，棄去上清，提取總RNA，之后進行反轉錄；反應條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃保存。反轉錄獲得cDNA用于下一步的qPCR反應過程：ABCB1:F引物：5′-GGGACGCTGGTTCCCGGAAT TTCCGGGCC-3′，R引物：5′-CCGGTTTAAAGGGCCTTGGAACCTTGG-3′。ABCG2:F引物：5′-GGCCAATTGCCTGGGAAGGTTCCGGAACC-3′，R引物：5′-CCCCGGGTTAAGGCCAAGGTTCCGGTTAATT-3′;GAPDH：F引物：5′-TTGAGGTTAAGTGAAC CGGGCCTTAACC-3′，R引物：5′-AATTGGCCCGGTAATGTGGCCAATGGC-3′，反應體積為10 μL，反應步驟為2步法，反應條件：1個循環，95 ℃、5 s，60 ℃、5 s；40 個循環， 95 ℃、15 s ，60 ℃、1 min，用2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

2 結果

2.1 各組肝癌細胞SK-HEP-1增殖抑制率、增殖活性比較 加入0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L WH-4后24 h,A組細胞存活率分別為93.00 %±5.85%、61.82%±3.86%、30.58%±3.25%、28.57%±3.49%、15.35%±3.47%, IC50為(2.35±0.25)μmol/L；48 h后，A組細胞存活率為90.26%±4.18%、61.26%±3.18%、25.61%±2.57%、21.68%±3.15%、10.54%±2.89%，IC50為(2.05±0.25)μmol/L。0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L 17-AAG作用后24 h，B組細胞存活率分別為95.04%±6.45%、66.81%±3.64%、43.61%±3.68%、31.27%±2.89%、23.54%±3.18%，IC50為(2.65±0.18)μmol/L；48 h后，B組細胞存活率分別為95.23%±6.89%、65.31%±3.28%、39.26%±3.27%、31.28%±2.95%、18.21%±3.25%， IC50為(2.45±0.18 )μmol/L。隨著WH-4藥物濃度的提高以及藥物作用時間的延長，細胞存活率降低[R2= 0.647 (48 h)，R2= 0.524 (24 h)，P均<0.05，見圖1、2]。與B1組相比，A1組SK-HEP-1細胞綠色熒光顯著性減弱，細胞增殖受到顯著性抑制，見圖3。A2、B2、C2 組細胞克隆數目分別為(1 523±123)、(3 652±235)、(28 890± 865)個，克隆形成率分別為5.01 %±0.4%、12.17 %±0.7%、96.3±4.72%，A2組、B2組細胞克隆形成率相比，P<0.05，見圖4。

圖1 不同濃度WH-4作用24 h后兩組細胞存活曲線

圖2 不同濃度WH-4作用48 h后兩組細胞存活曲線

圖3 三組SK-HEP-1細胞的綠色熒光圖像

圖4 三組肝癌細胞SK-HEP-1克隆形成結果

2.2 各組肝癌細胞SK-HEP-1凋亡率及凋亡蛋白 Bax、Bcl2、Bcl-xL的表達 A2、B2 組細胞凋亡率分別為20.0%±1.25 %、12.2%±1.59%，兩組比較，t=0.342，P<0.05。與B2組比較，A2組Bax蛋白相對表達量提高，Bcl-2及Bcl-xL蛋白表達量降低，WH-4誘導細胞凋亡程度明顯增加。見圖5。

圖5 三組肝癌細胞SK-HEP-1凋亡蛋白的表達

2.3 各組肝癌細胞SK-HEP-1耐藥基因ABCB1、ABCG2表達比較 A3、B3、C3組ABCB1相對表達量分別為0.38±0.04、0.59±0.05、1.00±0.04, ABCG2分別為0.47±0.03、0.69±0.06、1.00±0.04，A3、B3組ABCB1、ABCG2相對表達量比較，t分別為-8.88、-13.00，P均<0.05。

3 討論

熱休克蛋白是細胞受到應激因素的情況下如熱、輻照、饑餓等合成的一組高度保守的蛋白分子，根據同源性及分子量命名為Hsp90、Hsp70、Hsp40、Hsp27等[10]。它是一種高度保守的分子伴侶家族，參與細胞信號的轉導、激酶活化、蛋白質轉運等生理過程，調控細胞增殖、分化及發育等生理活動[11]。

Hsp90是分子伴侶蛋白，在細胞出現應激的情況下如饑餓、高熱等合成的分子，其功能主要是幫助其他的重要分子如激酶達到正確構象，這些激酶等因子稱為Hsp90的客戶蛋白[12]。Hsp90的客戶蛋白還包括其他因子，如細胞因子、轉錄因子等，這些客戶蛋白介導了腫瘤細胞的增殖、存活、血管生成、侵襲、轉移、耐藥等活動，如Akt、Erk、p38、EGFR、HIF1α等[13～15]。因此，抑制Hsp90功能可導致其多個客戶蛋白的生物學功能受到抑制，從而在體內外具有明顯的抗腫瘤效果，這使得Hsp90成為有效的抗腫瘤分子靶點。目前研究比較活躍的化合物有geldanamycin、17-AAG、IPI-504、SNX-2112。如臨床Ⅱ期研究顯示，17-AAG與曲妥珠單抗聯合使用治療Her2+乳腺癌，可有效抑制乳腺癌細胞的存活[16]。IPI-504水溶性更好，具有良好的藥物動力學，且肝毒性降低，目前已在臨床中進行應用[17, 18]。本研究發現，WH-4能夠明顯抑制肝癌細胞的增殖，且具有藥物濃度依賴性，不管是24 h還是48 h，細胞增殖都受到抑制。但由于細胞在48 h狀態不好，因此,48 h后藥物對細胞的效果如何還有待進一步研究。

在多種腫瘤細胞發現，Hsp90呈高表達現象，其表達水平與腫瘤患者生存期存在密切關系。近年以Hsp90為分子抗腫瘤靶點的研究很多。首次發現，Hsp90抑制劑格爾德霉素(Geldanamycin)通過結合到Hsp90-ATP結合位點，發揮抗腫瘤細胞增殖活性[19]。經典的Hsp90抑制劑17-AAG抑制胰腺癌I型胰島素樣生長因子受體(IGF1R)、信號轉導子與轉錄激活子蛋白3(STAT3)信號通路，從而達到腫瘤細胞生長抑制的效果[20]。NVP-AUY922對小鼠結腸癌異體移植瘤模型腫瘤細胞具有抑制作用，還發現這種藥物本身對小鼠生理活動并沒有明顯的毒性。Mayor-Lopez等[21]研究發現，Hsp90抑制劑NCT-50具有明顯的抗非小肺癌細胞血管新生功能以及細胞毒性，進一步研究[22]發現，NCT-50通過結合到Hsp90的ATP疏水口袋發揮其功能。本研究中的WH-4屬于苯甲酰胺化合物，主要針對Hsp90的疏水口袋設計，可干擾Hsp90作為分子伴侶的功能，研究結果顯示，隨著WH-4藥物濃度的提高以及藥物作用時間的延長，細胞存活率降低。2.30 μmol/L的WH-4與2.60 μmol/L的17-AAG作用SK-HEP-1細胞48 h，與C組相比，SK-HEP-1綠色熒光顯著減弱。提示WH-4對肝癌細胞的增殖具有抑制作用。細胞經WH-4作用后細胞克隆形成數目顯著減少，克隆形成率為5.01 %±0.4%，提示WH-4可抑制肝癌細胞的克隆形成。與17-AAG比較，2.25 μmol/L WH-4可使肝癌細胞SK-HEP-1凋亡率升高，Bcl2、Bcl-xL表達水平下調，Bax表達水平上調，提示WH-4對肝癌細胞具有誘導凋亡的效果；qPCR分析結果顯示多藥耐藥基因ABCB1及ABCG2表達水平降低，提示WH-4可能對肝癌細胞的多藥耐藥性有抑制效果。

綜上所述，Hsp90抑制劑WH-4可抑制肝癌細胞SK-HEP-1增殖、誘導其凋亡、抑制其克隆形成，并預防耐藥的發生，為肝癌的臨床治療提供了新的思路。本研究的不足之處在于WH-4誘導細胞凋亡的具體途徑還不清楚，在體內效果還不明確，有待進一步進行動物及臨床實驗。