以慢病毒為載體的人骨肉瘤細胞腎上腺髓質素RNA干擾體系的構建

戴星，楊康平，尹戰海，馬巍，楊益民，周曉玲，姚璐

(1西安交通大學第一附屬醫院，西安 710061；2西安交通大學醫學部基礎醫學院)

骨肉瘤是臨床上最常見的原發惡性骨腫瘤，好發于青少年及兒童，給社會和家庭造成極大負擔。目前臨床上骨肉瘤的治療，一直在嘗試改進化療方案和外科術式，一定程度上提高了患者生存率，但骨肉瘤總的預后并未得到顯著改善[1]。因此，尋找骨肉瘤惡性生物學行為的關鍵蛋白或關鍵基因，以阻斷或延緩骨肉瘤的生長和遠處轉移，并指導臨床治療具有至關重要的研究和應用意義。腎上腺髓質素(ADM)是一種最初從人類嗜鉻細胞瘤內分離出來的含有52個氨基酸的多肽，其結構與降鈣素基因相關肽具有同源性[2]。最初研究發現，ADM在腎上腺髓質中大量富集，能引起機體的持續低血壓反應。隨著進一步的深入研究發現，ADM廣泛分布于全身各處組織中，并且具有促血管生成[3]和促腫瘤生長作用[4]。骨肉瘤組織中ADM mRNA過度表達，ADM可能通過促進骨肉瘤中微血管的增生、部分緩解實體腫瘤的缺氧，從而促進骨肉瘤細胞的大量增殖，并有利于腫瘤局部浸潤和轉移[5]。因此，沉默ADM基因表達從而抑制骨肉瘤的生長也許是骨肉瘤治療的一種新途徑[6]。

RNA干擾(RNAi)技術因其作用穩定持久、特異而高效性受到廣泛重視。成功進行RNAi實驗的關鍵是設計并找到有效目標基因作用靶點，并在細胞內導入或者穩定表達shRNA。目前常用的主要有磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、陽離子脂質體法、病毒感染等。上述前三種方法在實際操作中插入目的基因的片斷很短，轉染效率相對較低，持續時間短且難以穩定表達shRNA片段，同時部分試劑存在較大的細胞毒性。因此本研究選擇了病毒感染方法沉默ADM基因。2018年2～8月，我們采用慢病毒載體系統，根據RNAi的設計原則，構建了針對人骨肉瘤細胞ADM的慢病毒RNA干擾體系，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 慢病毒、細胞、試劑和儀器 慢病毒載體體系(Genechem Co. Ltd. Shanghai, China)：由pHelper 1.0載體、GV-115載體和pHelper 2.0 載體三質粒組成。293T細胞株由中國科學院干細胞庫提供。TaqPolymcrase、DNA ladder Marker購自Takara公司；QIAGENPlasmidKit購自Qiagen公司；AgeⅠ限制性內切酶、EcoRI限制性內切酶、T4 DNA-ligase連接酶、T4 DNA - ligase buffer緩沖液購自NEB公司；瓊脂糖購自Biowest生物公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。1 mol/L CaCl2溶液：CaCl2·2H2O 17.7 g，去離子水100 mL。100 mg/mL氨芐青霉素：氨芐青霉素1 g，滅菌去離子水10 mL。分裝-20 ℃保存，以25～50 μg/mL濃度添加于生長培養基。LB液體培養基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、去離子水800 mL、加入適量NaOH調整pH 7.5、去離子水定溶至1 000 mL，高壓滅菌30 min。LB固體培養基：瓊脂粉15 g，LB液體培養基1 L，高溫高壓滅菌。PCR儀和Realtime PCR儀(美國Bio-Rad公司)；高速離心機(Sigma公司)；高度冷凍離心機(Micro CL17R型，THERMO IEC公司)；Gilson移液器(吉爾森公司)。

1.2 靶向ADM shRNA的設計 人類ADM mRNA的GENE BANK的序列號為NM_001124，根據其設計靶向ADM的shRNA候選序列3條，分別命名為shRNA-1、2、3，同時制備無意義鏈shRNA-scr作為對照，具體序列如下：shRNA-1:F:5′-CCGGGGAGGTAGGACTAACAAT-AAACTCGAGTTTATTGTTAGTCCTACCTCCTTTTTG-3′，R:5′-AATTCAAAAACTGGTGTCTTCTAAGCCACAACT-CGAGTTGTGGCTTAGAAGACACCAG-3′；shRNA-2:F:5′-CCGGCCCTAAACCATGGTTCTAAACCTCGAGGTTTAG-AACCATGGTTTAGGGTTTTTG-3′，R:5′-AATTCAAAAA-GATCTACCAGTTCACAGATAACTCGAGTTATCTGTGA-ACTGGTAGATC-3′；shRNA-3:F:5′-CCGGACATCCTTA-TCGACCTCAATCCTCGAGGATTGAGGTCGATAAGGAT-GTTTTTTG-3′，R:5′-AATTCAAAAACCGCCAGAGCATG-AACAACTTCTCGAGAAGTTGTTCATGCTCTGGCGG-3′；shRNA-scr:F:5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCA-AGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3′，R:5′-A-ATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAA-CGTGACACGTTCGGAGAA-3′。設計好的序列合成相應的DNAoligo單鏈，退火形成具有粘性末端的DNA雙鏈。將所得ADM-shRNA凍干粉劑用Rnase-free水配制成20 μmol/L的貯存液，分裝后置于-20 ℃保存。

1.3 靶向ADM shRNA與慢病毒載體的連接、鑒定 用限制性內切酶Agel和EcoR Ⅰ進行雙酶切后，使GV-115載體線性化。使用Fermentas T4連接酶，將酶切后的載體與DNA oligo進行連接，形成重組慢病毒GV-115載體。CaCl2法制備感受態大腸桿菌，將需轉化的質粒片段轉化至感受態大腸桿菌中，菌液均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上行定向篩選，37 ℃培養過夜。挑選LV-ADM-shRNA 1、2、3陽性克隆進行PCR鑒定(PCR引物序列：上游引物5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’，下游引物5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’； PCR反應體系：dNTPs(2.5 mmol/L)0.8 μL，10×buffer 2 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，Taq polymerase 0.2 μL，補足ddH2O至總體積為20 μL。溫度循環程序：72 ℃加熱6 min，85 ℃加熱30 s，94 ℃加熱30 s，其中85 ℃至94 ℃共30個循環)，經PCR鑒定證實質粒連接正確。3組shRNA序列送上海吉凱公司進行測序確認。

1.4 目的質粒的抽提、慢病毒包裝、慢病毒滴度的測定 保留鑒定成功的攜帶目的質粒的E.coli DH5α工程菌，蘸取少量菌液于5 mL BD搖菌管中搖菌8 h，隨后吸取2 mL小搖的菌液于500 mL LB生長培養基中繼續搖菌過夜擴大培養，次日使用DNA分離柱進行質粒的抽提。選擇狀態良好的293T細胞，加入20 μg 重組慢病毒GV-115載體，15 μg pHelper 1.0載體，10 μg pHelper 2.0載體，與同體積的轉染試劑Lipofectamine 2000混合均勻，調整總體積為1 mL。混合液緩慢加入細胞培養液中，于細胞培養箱中培養行慢病毒的包裝。更換為完全培養液培養48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，離心、過濾取病毒濃縮液。采用多孔稀釋法測定慢病毒的滴度。測定前1天，將測定滴度所需的293T細胞鋪96 孔板，每個孔加4×104個細胞，體積為100 μl。每8孔為一組更換成含8 μg/mL聚凝胺的完全DMEM，90 μL/孔，第一孔加入待測病毒原液10 μL，混勻后吸出10 μL加入第2孔，以此類推，倒數第2列內10 μL棄去，最后一列為對照組，5組復孔。32 ℃、1 000 g離心60 min。37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養，48 h后按病毒濃度由高至低觀察，確立計量孔，在熒光顯微鏡下觀察并計數出現綠色熒光的細胞數。 根據如下公式計算病毒滴度：病毒滴度(TU/mL)=m×10n+1(m為最后一陽性計量孔陽性細胞數,n為出現綠色熒光細胞的計量孔數)。

2 結果

2.1 構建的LV-ADM-shRNA載體的鑒定、測序結果 已成功連接LV-ADM-shRNA載體的陽性克隆PCR片段為350 bp，而未連接shRNA的空載體克隆PCR片段為306 bp(見圖1)，載體連接情況符合預期設計。3組shRNA序列經測序確認合成的寡核苷酸插入部位正確。

注：1：陰性對照ddH2O；2：空載體自連對照組；3：Marker；4～8：轉化子鑒定，其中部分產物低于正常轉化子高度的為陰性克隆。Marker自上而下依次為5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp。 圖A、B、C為LV-ADM-shRNA 1、2、3。

圖1慢病毒載體LV-ADM-shRNA陽性克隆PCR產物電泳圖

2.2 LV-ADM-shRNA質粒轉染293T細胞慢病毒滴度測定結果 使用不同濃度的慢病毒原液進行梯度濃度轉染后，熒光顯微鏡下觀察到的細胞熒光照片如圖2所示。根據以下熒光圖片中綠色熒光蛋白GFP 的表達情況，在加入1×106μL慢病毒原液的孔中觀察到2個帶有熒光的細胞，說明該孔中至少有2個慢病毒顆粒感染了細胞，慢病毒滴度為2×109TU/mL。

注：A:加入10 μL病毒原液；B:加入0.1 μL病毒原液；C:加入1×10-3μL病毒原液；D:加入1×106μL病毒原液。

圖2不同濃度的病毒原液轉染293T細胞的熒光圖像(100×)

3 討論

ADM為一個潛在的腫瘤血管生長因子，可以刺激骨肉瘤新生微血管的增生，緩解骨肉瘤內部的缺氧狀態，通過探討DM在骨肉瘤發生發展中的作用，將為骨肉瘤的診斷與治療等提供一個新的分子生物學指標，而建立以ADM為核心的治療方案很有可能成為治療骨肉瘤的新途徑。因此，本實驗選擇以人骨肉瘤細胞的ADM為作用靶點，建立以慢病毒為載體的RNA干擾體系，實現高效抑制ADM基因表達。RNAi是一種特殊而神奇的基因沉默現象，是通過雙鏈RNA抑制目的基因的翻譯或轉錄來實現抑制目的基因表達。當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默。RNAi是體內抵御外在感染的一種重要保護機制，病毒自身基因組所包含的或在病毒復制過程中產生的雙鏈RNA可以被Dicer識別，從而引起病毒RNA降解[7]。同時RNAi也是抑制破壞基因結構的一種DNA片段轉錄子活性的重要方式，轉錄子通常以逆轉錄的方式在基因組中擴增，在逆轉錄過程中產生的雙鏈RNA分子同樣可以被Dicer識別，從而被降解[8]。

常用的病毒載體主要有RNA病毒載體和DNA病毒載體兩類，RNA病毒載體包括逆轉錄病毒載體和慢病毒；DNA 病毒包括腺病毒載體、腺相關病毒載體、單純皰疹病毒載體等。目前操作技術最成熟，實際操作常用并能實現高效轉染的是慢病毒載體。慢病毒屬于逆轉錄病毒的一種，是人類免疫缺陷病毒-1來源的一種病毒載體。相比于其他病毒，慢病毒有兩個突出優點：①可以整合到靶細胞的基因組，能夠較長時間持續表達；②經過慢病毒系統的包裝和改造后，可以感染人的絕大多數細胞，即使是未處于分裂期的細胞仍然可以高效感染。另外，與逆轉錄病毒比較，慢病毒的基因組更復雜，所以它的復制周期也更長。除去與逆轉錄病毒的相同基因組結構外，慢病毒還有在其復制周期中起著重要作用的輔助基因，如Tat、Rev是其病毒基因高效表達所必需的。Tat激活LTR區的啟動子從而使病毒RNA鏈得以有效延伸。Rev通過與病毒RNA鏈上的rre相互作用，促進未完全剪切的病毒mRNA輸出到細胞核外，以便于被細胞質中的剪切因子剪切變成成熟mRNA從而表達病毒蛋白[9]。在臨床基因治療實踐中，由于很多靶細胞屬于非分裂細胞，因而逆轉錄病毒的應用受到很大限制，但慢病毒可以感染非分裂細胞，感染那些在G0到G1b期就可以完整有效完成病毒基因組轉錄的非分裂細胞，因而慢病毒載體在臨床基因治療中擁有廣闊的前景[10～13]。

本研究中采用慢病毒載體作為實施RNAi的工具，對ADM基因實施高效特異性抑制。通過構建慢病毒載體，設計3條針對ADM基因靶序列的shRNA序列，根據PCR結果判斷，靶向ADM shRNA與GV115載體連接情況符合預期設計，即經測序確認合成的寡核苷酸插入部位正確。為保證載體攜帶的目的基因的表達效率，需要獲得具有較高滴度的病毒。病毒滴度取決于具有感染能力的病毒顆粒與無感染能力的病毒顆粒的比例。利用病毒包裝技術所得的慢病毒滴度在理論上可達108～109TU/mL，但是在實際試驗操作中獲得的病毒滴度常低于108/mL。為了得到病毒滴度更高的病毒包裝系統，本研究通過對病毒包裝的輔助結構以及載體結構進行了優化，現已能獲得滴度高達2×109TU/mL的慢病毒表達載體。主要優化方法如下：①對GV-115載體進行改造，以Agel和EcoR Ⅰ雙酶切得到線性化質粒，同時加入rev基因編碼調節因子，促使gag-pol基因及其融合蛋白表達，提高病毒的包裝效率；②病毒載體mRNA的豐裕度以及包裝信號序列長度對病毒滴度水平具有重大影響，本研究使用了全長mRNA以及經過擴展的包裝信號序列。經過上述改進方法包裝的病毒，經滴度測定，獲得較高滴度(2×109TU/mL)的慢病毒顆粒，為后續實施ADM基因的沉默，在體實驗中觀察對骨肉瘤的抑制效果奠定了實驗基礎。