黃連素對H9c2心肌細(xì)胞缺氧性損傷大鼠巨噬細(xì)胞功能的影響

王 鵬 郭志坤

缺血性心臟病、心臟手術(shù)后心功能不全最主要的病理基礎(chǔ)之一為心肌缺血再灌注損傷（IR），一旦出現(xiàn)IR，將會影響臨床治療效果，對于如何防治IR成為醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)課題。近年有研究報(bào)道，中藥提取物黃連素（berbreine，BBR）可調(diào)控IR及促進(jìn)炎癥因子水平下降，這為臨床治療提供了一種治療思路［1］。為了進(jìn)一步探討其應(yīng)用價(jià)值，本研究就黃連素對H9c2心肌細(xì)胞缺氧損傷大鼠的巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控作用及效果進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1材料 本研究涉及的材料主要包括RMPI培養(yǎng)基、胎牛血清、巨噬細(xì)胞高遷移率族蛋白（HMGB1）抗體、CCK-8試劑盒、羊抗兔二抗抗體、羅丹明123、二甲基亞砜、胰蛋白酶等。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 從SD大鼠股骨骨髓前體細(xì)胞取原代培養(yǎng)骨髓性巨噬細(xì)胞（Bone marrow-derived macrophages，BMDM），以巨噬細(xì)胞集落因子 100 ng／ml刺激，持續(xù)6 d，誘導(dǎo)成研究所需BMDM；以RMPI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，并輔之以胎牛血清（10%），放于37℃、5%CO2溫度計(jì)飽和濕度下，并完成心肌細(xì)胞生長及傳代。

1.2.2吸光度值檢測 采用CCK-8試劑盒檢測。單獨(dú)培養(yǎng)（僅BMDM）、聯(lián)合培養(yǎng)（BMDM＋大鼠H9c2心肌細(xì)胞）均經(jīng)10μmol／L BBR處理24 h。聯(lián)合培養(yǎng)下，誘導(dǎo)成熟BMDM且消化心肌細(xì)胞重懸后，種植在BMDM孔板，根據(jù)每孔6×103個(gè)種植，共計(jì)96孔，經(jīng)BBR處理后，加入稀釋后的CCK-8，每孔均加入，孵育2～4 h，以紫外分光光度計(jì)檢測吸光度值。

1.2.3HMGB1檢測 以3×106個(gè)／孔，將大鼠BMDM種植在6孔板，經(jīng)10μmol／L BBR處理24 h，在4℃下用蛋白酶抑制劑細(xì)胞裂解液（RIPA）進(jìn)行40 min裂解，每孔加入120μl裂解液，收集后離心15 min，速率12 000 r／min，取上清液，用BCA法測定濃度。樣本經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)膜，3%BSA封閉，加一抗孵育過夜，溫度4℃，TBST進(jìn)行3次洗滌，加入二抗，室溫下孵育2 h，洗滌后顯影。

1.2.4炎性因子測定 利用Elisa法檢測細(xì)胞炎性因子IL-6與IL-1β。

1.2.5H9c2細(xì)胞凋亡水平測定 用流式細(xì)胞儀測定H9c2細(xì)胞凋亡水平，聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞在24孔板，用BBR處理24 h，收集H9c2細(xì)胞，離心洗滌，用雙染標(biāo)記細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，重復(fù)3次，取均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)；計(jì)量資料以x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)BBR處理前后心肌細(xì)胞活性比較 單獨(dú)培養(yǎng)BMDM、聯(lián)合培養(yǎng)（BMDM＋大鼠H9c2心肌細(xì)胞）經(jīng)10μmol／L BBR處理均無毒性作用（均P＞0.05）。見表1。

表1 BBR處理前后心肌細(xì)胞活性情況比較／（x±s）%

表1 BBR處理前后心肌細(xì)胞活性情況比較／（x±s）%

與處理前比較，*P＞0.05；聯(lián)合培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)比較，△P＞0.05

組別 處理前 處理后t P單獨(dú)培養(yǎng) 95.45±0.43 94.83±0.55*＞0.05 ＞0.05 0.2011＞0.05聯(lián)合培養(yǎng) 93.84±1.47△94.74±0.52*△0.1992＞0.05 t 0.8932 0.0983 P

2.2HMGB1、炎性因子水平比較 與BBR處理前比較，處理后可顯著降低HMGB1與炎性因子水平（均P＜0.05）。見表2。

表2 處理前后HMGB1、炎性因子水平比較/±s，pg／ml

表2 處理前后HMGB1、炎性因子水平比較/±s，pg／ml

處理時(shí)間 HMGB1 IL-6 IL-1β處理前689.53±58.77 576.45±20.35 860.53±20.34處理后 400.30±43.26 302.31±43.29 568.64±72.12 t 13.2093 12.1092 14.0027 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3對巨噬細(xì)胞凋亡的調(diào)控效果 聯(lián)合培養(yǎng)中，10 μmol／L BBR處理后，可降低H9c2細(xì)胞熒光強(qiáng)度與心肌細(xì)胞凋亡率，即可調(diào)控巨噬細(xì)胞而降低缺氧細(xì)胞凋亡。見表3。

表3 聯(lián)合培養(yǎng)不同條件處理下心肌細(xì)胞凋亡指標(biāo)比較/±s

表3 聯(lián)合培養(yǎng)不同條件處理下心肌細(xì)胞凋亡指標(biāo)比較/±s

組別 熒光強(qiáng)度（AU） 凋亡率（%）缺氧組124.47±20.46 4.89±0.23 BBR處理組 59.65±8.44 1.74±0.06 t 4.3021 2.3894 P ＜0.05 ＜0.05

3 討論

溶栓、冠脈介入及冠脈搭橋手術(shù)均屬于治療心肌梗死常用的手段，但在血管化后容易引發(fā)心肌缺血再灌注損傷，對預(yù)后會造成不利影響［2］，如何降低心肌梗死治療后IR發(fā)生成為研究的熱點(diǎn)。心肌細(xì)胞凋亡屬于IR主要病理變化，長期心肌細(xì)胞凋亡會造成心肌舒張功能下降，進(jìn)展后會合并心肌收縮功能障礙。因此，減少IR期心肌細(xì)胞損傷可作為預(yù)防這類不良事件的關(guān)鍵。

HMGB1是一類結(jié)合DNA的核內(nèi)蛋白，對維持基因組穩(wěn)定有著重要作用，當(dāng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞損傷后，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被破壞時(shí)，從細(xì)胞中釋放出來，伴隨細(xì)胞壞死，主動表達(dá)增高，經(jīng)細(xì)胞漿釋放，多見于免疫細(xì)胞［3］，比如巨噬細(xì)胞，為此，該因子的升高與釋放能促進(jìn)機(jī)體抗炎與免疫功能調(diào)節(jié)。此外，該因子自身也有調(diào)控其他炎癥因子分泌的作用，可見有著復(fù)雜的病理生理功能［4］。BBR屬于傳統(tǒng)中藥黃連活性成分，證實(shí)有多類藥理效果，可調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝、脂肪代謝，在糖尿病、腎病中治療均有應(yīng)用，但其主要應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)榭剐难苎趸瘬p傷，可影響P13K-Akt信號通路，影響心肌細(xì)胞自噬水平，降低缺血再灌注損傷，從而保護(hù)心肌細(xì)胞［5］。

在本研究中，將單純 BMDM、BMDM聯(lián)合大鼠H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，單獨(dú)培養(yǎng)與聯(lián)合培養(yǎng)經(jīng)10μmol／L BBR處理均無毒性作用，可顯著降低HMGB1與炎性因子水平（均P＜0.05）；聯(lián)合培養(yǎng)中，10μmol／L BBR處理后，可調(diào)控巨噬細(xì)胞而降低缺氧細(xì)胞凋亡。

綜上所述，H9c2心肌細(xì)胞缺氧損傷大鼠用BBR處理有一定的調(diào)控巨噬細(xì)胞與促炎癥功能，進(jìn)而達(dá)到修復(fù)缺損心肌細(xì)胞的作用，值得進(jìn)一步探索。