血漿長鏈非編碼RNA ANRIL在缺血性腦卒中診斷及預后中的價值

何平 劉家豐 寧瑞卓 鄒曉微 申龍健 范文慧

[摘要]目的 分析血漿長鏈非編碼RNA INK4位點反義非編碼RNA（antisense noncoding RNA in the INK4 locus，AN-RIL）聯合脂蛋白相關磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2）及血漿淀粉樣蛋白A（serum amyloid A，SAA）在缺血性腦卒中（ischemic stroke，LS）的診斷、預后價值。方法分別收集我院IS患者和健康人群各140例作為觀察組和對照組。血漿ANRIL采用實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測;Lp-PLA2與SAA分別采用酶聯免疫吸附法和化學發光法檢測。結果觀察組血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平均顯著高于對照組（P<0.05）。LS患者血漿4NRIL，Lp-PLA2與SAA水平與NIHSS評分顯著相關（r=0.57，P<0.05;r=0.55，P<0.05;r=0.54，P<0.05）。ANRIL聯合Lp-PLA2與SAA在區分IS與健康對照者的曲線下面積為0.95（95% CI：0.91～0.99，P<0.05），靈敏度82.71%，特異度98.42%。在校正年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥等影響因素后，高ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平是IS發病的獨立危險因素。Kaplan Meier生存分析發現，相比低ANRIL組，高ANRIL組生存時間顯著降低（χ²=17.66，P<0.05）;相比低Lp-PLA2組，高Lp-PLA2組生存時間顯著降低（χ²=8.94，P<0.05）;相比低SAA組，高SAA組生存時間顯著降低（χ²=4.53，P<0.05）。結論 血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA是IS診斷及預后評估的潛在標志物。

[關鍵詞]缺血性腦卒中;長鏈非編碼RNA;脂蛋白相關磷脂酶A2;血漿淀粉樣蛋白A

中圖分類號：R743 文獻標識碼：A 文章編號：1009-816X（2019）05-0397-04

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.05.003

腦卒中是一種因突發性腦血管發生阻塞或破損導致大腦供血不足/失去供血而使腦組織缺氧受損的疾病，其中，又以缺血性腦卒中（ischermc stroke，IS）最為常見[1]。炎癥反應可促進血管內皮細胞損害，進而加快粥樣斑塊在損傷的內皮細胞表面沉積，加速IS的形成[2]。因此，炎癥指標升高被認為是IS形成的一個重要誘因[3]。研究指出，長鏈非編碼RNA（longnon-coding RNA，lnCRNA）INK4位點反義非編碼RNA（antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL）水平在經缺氧或高血糖誘導的內皮細胞中顯著上調，被認為是參與調節血管內皮細胞功能的重要分子[4]。脂蛋白相關磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholi-pase A2，Lp-PLA2）是一類重要的血管炎癥標志物，其水平增高被認為是誘發心血管疾病的高危因素[5]。血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A，SAA）屬于急性相反應蛋白，對于評估體內炎癥程度有一定價值[6]。本研究通過比較IS患者與健康體檢者血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平，旨在探究三者在IS診斷及預后評估中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集本院2017年1月到2018年1月期間經CT或MRI確診IS的患者140例為觀察組，其中男93例，女47例，年齡48～66歲，平均（58.31±5.81）歲，并計算國立衛生院卒中量表（national insti-tutes of health stroke scale，NIHSS）評分[7]。同期納入我院健康體檢者140例為對照組，其中男95例，女45例，年齡49～67歲，平均（60.11±6.32）歲。兩組患者一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05）。樣本例數計算的統計學依據為：n=2&μ_α+μ_β）2γ²/δ²，其中μ_α為一類錯誤概率μ的值，本次研究規定α=0.05，查表得μ_α為1.96;μ_β為二類錯誤概率μ的值，本次研究規定β=0.20，查表得μ_β為0.84;γ²為總體方差，查表得γ（0.05，0.20）²為12.65;δ為觀察組與對照組的患病率之差，因人群中IS發病率約為15%，故δ值約為0.85。最終計算得到的病例標本量至少應為127例。本研究的開展經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法：收集研究對象吸煙史、飲酒史、高血壓（收縮壓/舒張壓大于140/90mmHg或高血壓病史或正在服用降壓藥者）、糖尿病（空腹血糖大于126mg/dL或糖尿病史或正在服用降血糖藥物）、高膽固醇血癥（正在服用降脂藥物）等資料。此外，對納入的140例IS患者進行3個月的隨訪。采用乙二胺四乙酸抗凝紫管采集觀察組入院2h后及對照組外周靜脈血2mL，并于1h內分離血漿。血漿SAA的檢測采用化學發光法，試劑由上海百蕊生物科技有限公司提供。采用酶聯免疫吸附法檢測兩組血漿Lp-PLA2水平，檢測試劑盒購自北京金山川科技發展有限公司。按照血漿RNA提取試劑盒說明書步驟進行總RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因組逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測。反應采用20[L體系，即：SYBR GREEN Mix 8μL，上下游引物各0.80μL，cDNA4μL，去除RNA酶水6.40μL。循環條件：95℃變性5min;95℃30s，58℃30s，72℃ 30s，38個循環。使用的ANRIL與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物序列見表1。采用2^-△Ct法計算ANRIL的相對表達量，△Ct值=樣本Ct值-GAPDH Ct值。

1.3 統計學處理：應用SPSS 19.0版軟件分析。正態分布計量數據用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。計數資料用率表示，組間比較采用卡方檢驗。相關性分析采用斯皮爾曼檢驗。采用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）計算ANRIL、Lp-PLA2與SAA對IS的鑒別價值。采用二元Logistic回歸計算三者預測is風險的比值比（odds ra-tio，OR）。采用Kaplan-Meier法進行生存曲線分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床資料及血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平比較：與對照組相比，觀察組血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平顯著升高（P<0.05），見表2。

2.2 血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平與IS臨床特征間的相關性：血漿ANRIL、Lp-PLA2及SAA水平與IS患者NIHSS呈線性關聯，見表3。

2.3 ROC曲線分析：血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA區分IS患者與健康對照者的曲線下面積分別為0.91（95%CI：0.88～0.99，P<0.05）、0.88（95%CI：0.83～0.95，P<0.05）和0.67（95%CI：0.59～0.78，P<0.05）;靈敏度及特異度分別為81.21%/83.72%、77.10%/81.42%和70.11%/57.93%;截斷值分別為17.32（-log）、220.83μg/L和28.22mg/L（圖1A）。聯合血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA時，3種指標在區分IS患者與健康對照者的曲線下面積為0.95（95% CI：0.91～0.99，P<0.05，圖1B），靈敏度82.71%，特異度98.42%。

2.4 ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平對IS發生風險的預測價值：單因素分析結果顯示，高ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平是IS發病的危險因素。多因素分析顯示，在校正年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥等因素影響后，高ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平是IS發病的獨立危險因素。見表4。

2.5 血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA水平對LS患者的生存分析：140例IS患者中死亡28例。依據ANRIL、Lp-PLA2與SAA中位數分別分為各高、低水平組。高ANRIL組患者的生存時間較低ANRIL組顯著降低（χ²=17.66，P<0.05，圖2A）;高環-PLA2組患者的生存時間較低Lp-PLA2組顯著降低（χ²=8.94，P<0.05，圖2B）;高SAA組患者的生存時間較低SAA組顯著降低（χ²=4.53，P<0.05，圖2C）。

3 討論

隨著1ncRNAs參與IS機制研究逐漸深入，1ncR-NA通過炎癥反應通路在IS進程中的作用有了越來越深入的了解。本研究探討了ANRIL在IS中的臨床價值，發現IS患者血漿ANRIL水平明顯高于健康對照，且與NIHSS評分相關。近年來，越來越多的證據表明ANRIL和心血管疾病如心肌梗死、糖尿病視網膜病變等關系密切[8，9]。近期有研究發現，ANRIL參與內皮細胞炎癥的發生，而在敲除ANRIL后可以顯著降低多種促炎癥因子的表達[8]。Schulz等[9]發現ANRIL表達水平的增高可以促進微血管滲漏和炎癥反應等的發生，而降低ANRIL的表達可提高視覺功能并能降低糖尿病誘導的促炎癥蛋白的表達。這些研究表明，IS患者血漿中ANRIL水平的增高可能參與了機體的炎癥反應。本文通過臨床樣本檢測出IS患者高水平血漿ANRIL的表達，與前期的基礎研究結果相一致[8，9]。

Lp-PLA2主要是由巨噬細胞合成釋放，是反映血管炎癥的重要標志物之一，國內外研究也指出高水平Lp-PLA2是心血管疾病的危險因素[10，11]。本研究結果表明，與健康對照組相比，IS患者血漿Lp-PLA2水平顯著上升，分析主要是由于IS患者腦脊液中Lp-PLA2由血腦屏障進入外周血造成。SAA是評估機體急性相反應程度的重要生物學指標，其在提示機體氧化應激狀態下所引起的炎癥反應方面具有較高的靈敏度[12，13]。血管內皮細胞炎癥與氧化應激是IS發生的重要病理基礎。本文通過臨床樣本檢測出IS患者高水平血漿SAA的表達，與前期的基礎研究結果相呼應[12，13]。

ROC曲線分析顯示，血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA區分IS患者與健康對照者時具有一定的價值，當聯合ANRIL、Lp-PLA2與SAA指標時在區分IS患者與健康對照者的特異度達到98.42%，提示聯合上述三種標志物具有較高的臨床應用價值。在校正年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥等多個傳統IS風險因素影響后，本文發現血漿高ANRIL、高Lp-PLA2與高SAA水平是IS發病的獨立危險因素。進一步的生存分析也提示，高ANRIL、高Lp-PLA2與高SAA水平患者的預后較低水平者更差。上述研究提示，血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA在IS診斷及預后中具有重要臨床價值。

綜上所述，本文發現血漿ANRIL、Lp-PLA2與SAA的差異表達在用于IS患者診斷及預后評估時具有較高價值。

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（收稿日期：2019-5-19）

作者單位：150010 黑龍江哈爾濱市第一醫院神經內科

作者簡介：何平（1986-），碩士，醫師