LncRNA MEG3在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及對增殖、侵襲與轉移能力的影響

崔大煒++++++姜峰++++++陳大欣

[摘要] 目的 探討lncRNA MEG3在甲狀腺乳頭狀癌中的表達意義以及對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、侵襲轉移能力能力的影響。 方法 收集2012年5月～2015年12月于遵義醫學院第五附屬珠海醫院手術切除的甲狀腺乳頭狀癌標本以及對應的癌旁組織，采用real-time PCR技術分別檢測68例甲狀腺乳頭癌組織中MEG3表達情況，并分析其表達情況與臨床病理參數的關系；通過細胞轉染技術構建MEG3高表達甲狀腺癌TPC-1細胞系，利用CCK-8方法檢測MEG3對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖能力的影響；采用Transwell方法檢測MEG3對甲狀腺乳頭狀癌細胞侵襲遷移與轉移能力的影響；利用Western blot方法檢測過表達MEG3基因后對甲狀腺乳頭狀癌細胞Snail2蛋白表達的影響。 結果 lncRNA MEG3在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義（P < 0.05）；MEG3在甲狀癌組織中的表達與腫瘤大小、TNM分期有關（P < 0.05），與其他病理參數無關（P > 0.05）；TPC-1細胞系中過表達MEG3可使甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖能力降低，并且能夠抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的侵襲與轉移能力（P < 0.05）。real-time PCR和Western blot檢測發現，過表達MEG3能夠顯著抑制Snail2基因與蛋白的表達（P < 0.05）。 結論 lncRNA MEG3在甲狀腺乳頭狀癌中表達顯著降低且與甲狀腺的發生發展相關。MEG3能夠顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖能力，且能夠通過抑制Snail2蛋白的表達抑制狀腺癌細胞的侵襲與轉移能力。

[關鍵詞] MEG3；甲狀腺乳頭狀癌；長鏈非編碼RNA

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（b）-0015-05

[Abstract] Objective To investigate the expression of lncRNA MEG3 in papillary thyroid carcinoma and explore the effect of MEG3 on proliferation， migration and invasion in PTC-1 cells. Methods 68 cases of papillary thyroid carcinoma specimens and paired normal tissue were collected after surgery from May 2012 to December 2015 in the Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical College. The expression of MEG3 was analyzed by quantitative real-time PCR. The effect of MEG3 on proliferation in TPC-1 cells was detected by CCK-8 method. The effect of MEG3 on migration and invasion abilities of TPC-1 cells were analyzed by Transwell assays. The expression of Snail2 was detected by Western blot. Results The expression of MEG3 was lower in papillary thyroid carcinoma tissues than adjacent normal tissues （P < 0.05）. The expression of MEG3 was related with TNM stage and tumor size （P < 0.05）. Over expressed MEG3 significantly inhibited the proliferation of TPC-1 cells （P < 0.05）. And MEG3 could decrease the abilities of migration and invasion by down regulating the expression of Snail2 （P < 0.05）. Conclusion The expression of lncRNA MEG3 is lower in the papillary thyroid carcinoma and can inhibit the proliferation， migration and invasion of TPC-1 cells can be inhibited by the expression of Snail2.

[Key words] MEG3； Papillary thyroid carcinoma； lncRNA

甲狀腺癌（Thyroid cancer，TC）是常見的內分泌惡性腫瘤之一，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是其中最常見的病理類型。其發病率呈逐年上升的趨勢且在頭頸部腫瘤中占主要地位[1-2]。近幾年研究發現，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腫瘤的發生發展過程中起到了重要的調控作用[3]。越來越多的研究證實，許多lncRNA在甲狀腺癌中具有差異性表達且能夠影響甲狀腺癌的惡性生物學行為[4-6]。其中，lncRNA母系印記基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）作為通過表觀遺傳學受到表達調控的抑癌基因[7]，引起了人們廣泛的關注與研究，而MEG3在甲狀腺乳頭狀癌中的表達情況和意義尚不十分清楚。本研究擬通過檢測MEG3在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達情況，探討MEG3對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、侵襲與轉移能力的影響。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

68例甲狀腺乳頭狀瘤標本及相對應的癌旁組織為2012年1月～2015年12月于遵義醫學院第五附屬珠海醫院行手術切除。所有標本手術切除后立即放置于液氮中并存儲于-80℃冰箱以備實驗使用。病理診斷由術后病理切片檢測為標準。所有患者術前均未進行碘131等治療。其中男性29例，女39例；年齡36～69歲，平均（44.7±5.4）歲，其中<45歲38例，≥45歲30例；腫瘤直徑<2 cm者44例，≥2 cm者24例；腫瘤病灶單發38例，多發30例；低分化28例，中、高分化56例；有淋巴結轉移21例，無淋巴結轉移47例。本研究通過醫院醫學倫理審查，所有標本檢測均經患者及其家屬同意，并簽署知情同意書。

1.2 real-time PCR

所有甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織剪碎后，用Trizol試劑（invitrogen，San Diego，USA）提取組織總RNA，根據試劑盒說明書將總RNA逆轉錄成cDNA。實時熒光定量PCR反應（real-time PCR）體系按照SYBR Green說明書配制。real-time PCR反應條件：95℃持續3 min；95℃變性5 s，退火60℃ 30 s，共40個循環。以MEG3基因與內參GADPH相對濃度的比值來表示MEG3基因的表達量，相對表達量計算方式采用2-△△Ct法。MEG3基因的上游引物序列：5′-GCCAAGCTTC？鄄TTGAAAGGCC-3′，下游引物序列：5′-TTCCACGGAG？鄄TAGAGCGAGTC-3′；Snail2上游引物序列：5′-GAGGCGGTGGCAGACTAG-3′，下游引物序列：5′-GACACATCGGTCAGACCAG-3′；GADPH的上游引物序列：5′-CATGGAATCCTGTGGCATCC-3′，下游引物序列：5′-TGATCTTCATGGTGCTGGG？鄄A-3′。

1.3 Western blot檢測

將轉染MEG3質粒48 h的TPC-1細胞，利用RIPA裂解液將細胞裂解，蛋白樣本利用SDS-PAGE 電泳分離蛋白，然后電轉移至PVDF膜并用封閉液封閉2 h或4℃封閉過夜；轉膜后孵育Snail 2（Abcam，USA）、β-actin抗體（Proteintech，USA）后4 ℃溫育過夜。用TBST洗3次，每次10 min；加入ECL化學發光試劑（Pierce，USA）A、B各1 mL，混勻，浸透PVDF膜；暗室中進行顯影。定量方法可利用Image J進行灰度值分析并與內參β-actin進行比值。

1.4 細胞培養與轉染

甲狀腺癌TPC-1細胞系購于中科院細胞庫，利用含15%胎牛血清的DMEM培養基培養。MEG3過表達質粒pcDNA3.1-MEG3購于基凱基因公司（上海），空載質粒pcDNA3.1-NC為陰性對照。利用Lipofectamine 2000（Invitrogen）根據說明書進行轉染。轉染效率利用qRT-PCR檢測。

1.5 細胞增殖實驗

細胞增殖利用CCK-8方法進行驗證。在96孔板中加入轉染pcDNA3.1-MEG3的TPC-1細胞系，100 μL/每孔（約3×103細胞）。對照組加入轉染pcDNA3.1-Nc的TPC-1細胞。分別在0、24、48、72 h進行細胞增殖檢測。每孔加入10 μL的CCK-8溶液在37℃培養3 h。在450 nm進行吸光度檢測細胞數量。

1.6 侵襲和遷移實驗

將轉染pcDNA-MEG3質粒和空載質粒的TPC-1細胞調整細胞濃度于5×105個/mL細胞懸液，分別置于24孔、8 μL的Transwell小室上層，侵襲實驗中在上層底部覆蓋Matrigel生物膠。并在上室中加入100 μL不含胎牛血清的RPMI1640培養液，在下室中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養液，每組3個復孔。37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養48 h后，將小室取出，用無水酒精固定15 min，結晶紫固定20 min，將小室倒置于相差倒置顯微鏡下觀察穿過半透膜附著于小室下層的細胞，任意選取5個視野，計數每高倍視野平均細胞數并同時照相。

1.7 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA MEG3在甲狀腺乳頭狀癌中的表達情況

real-time PCR檢測結果顯示，MEG3在甲狀腺乳頭狀癌中的相對表達值為0.36±0.08，癌旁組織中的相對表達值為0.85±0.17，MEG3在癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 甲狀腺乳頭狀癌中MEG3的表達與患者臨床病理特征之間的關系

為了進一步了解MEG3對于甲狀腺癌發生發展的影響，本研究分析甲狀腺乳頭狀癌組織中MEG3的表達與臨床病理參數之間的關系。以MEG3表達的中位值為臨界值，將68例甲狀腺癌病例分為MEG3高表達組（34例）和MEG3低表達組（34例）。結果提示：甲狀腺乳頭癌中MEG3表達與TNM分期和腫瘤大小顯著相關（P < 0.05），而與患者性別、年齡、病灶數、淋巴結轉移無關（P > 0.05）。見表1。

2.3 MEG3對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖能力的影響

為了探索MEG3對于甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖能力的影響，本研究通過CCK-8方法檢測增殖曲線的變化。首先，通過細胞轉染技術構建過表達MEG3的TPC-1細胞系，其轉染后比空載對照組MEG3表達上升（P < 0.05）。然后，利用CCK-8方法分別在0、24、48、72 h檢測細胞含量，分析結果表明MEG3過表達后能夠顯著抑制TPC-1細胞的增殖能力（P < 0.05）。見圖2。endprint

2.4 MEG3對甲狀腺乳頭狀癌細胞侵襲轉移能力的影響

為了探求MEG3對于甲狀腺乳頭狀癌細胞侵襲轉移能力的影響，通過細胞轉染技術構建過表達MEG3的TPC-1細胞系，以空載質粒為對照組，利用Transwell小室培養48 h，結晶紫染色，顯微鏡下放大200倍進行觀察。結果顯示，MEG3能夠顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1侵襲與轉移能力（P < 0.05）。見圖3。

2.5 MEG3對甲狀腺乳頭狀癌細胞Snail2表達的影響

諸多研究表明，Snail2在腫瘤細胞侵襲轉移能力中起到了重要的作用。因此，本研究通過PCR、Western blot實驗探求MEG3基因對于甲狀腺乳頭狀癌細胞Snail2的表達是否起到了調控作用。如圖4所示，當過表達MEG3基因后TPC-1細胞中Snail2蛋白與mRNA的表達顯著降低（P < 0.05）。

3 討論

哺乳動物基因組中超過90%的基因均無編碼功能，在過去人們一直認為這些基因是無功能的。而隨著人類基因計劃的完成，一直認為是“轉錄噪聲”的非編碼RNA被證實在細胞的生命活動中發揮著重要的調控功能[8]。其中根據長度分類，人們將長度大于200個堿基的非編碼RNA稱為lncRNA[9]。不斷有研究證實，許多lncRNA在甲狀腺中存在差異性表達，并且能夠對甲狀腺癌的發生發展產生影響[4，10-11]。Li等[12]發現lncRNA n340790在甲狀腺癌中差異性高表達，并且能夠通過海綿效應直接吸附miR-1254從而促進甲狀腺癌細胞增殖。Luo等[13]通過對64例甲狀腺癌組織進行檢測后發現，lncRNA-PANDAR呈高表達趨勢，并且通過細胞學體外實驗證實lncRNA-PANDAR能夠促進甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲能力，抑制細胞的凋亡。諸多研究均表明lncRNA在甲狀腺癌中發揮了重要的調控作用。

lncRNA MEG3位于人類染色體14q32.2位置，在正常組織中具有一定表達水平[7]。而在許多腫瘤中，MEG3被發現在癌組織中表達下降[14-15]。并且通過進一步研究證實，MEG3能夠通過表觀遺傳學在基因轉錄時受到甲基化水平的調控作用，因而其基因表達受到抑制[16-17]。如在胃癌研究中，miR-148a能夠通過抑制DNA甲基化轉移蛋白酶1（DNA methyltransferase，DNMT1）從而影響MEG3的表達[18]。而隨著研究的不斷深入，人們發現MEG3作為一個抑癌基因不僅能夠作為輔助診斷腫瘤發生的分子生物標記物，而且能夠在多個層面影響腫瘤細胞的惡性生物學行為。如：人們發現MEG3能夠抑制膀胱細胞增殖能力的同時，也能夠抑制其自噬的發生[19]。Zhang等[20]發現在宮頸癌中，MEG3能夠通過發揮內源性干擾RNA的功能吸附miR-21，促進宮頸癌細胞上凋亡的發生。綜上所述，lncRNA MEG3在腫瘤發生發展過程中發揮了重要的調節作用，而其對甲狀腺癌的影響尚處于探索階段。

本研究通過對68例甲狀腺乳頭狀癌臨床組織標本檢測發現，MEG3在甲狀腺癌中呈相對低表達水平。結合臨床病理參數分析發現，MEG3的表達與TNM分期和腫瘤大小相關，與其他參數無關。再進一步細胞學實驗中，本研究發現MEG3能夠顯著促進甲狀腺乳頭狀癌中TPC-1細胞的增殖、侵襲和轉移能力，在基因表達層面本研究通過檢測發現MEG3能夠顯著抑制與腫瘤上皮間質化相關的基因Snai2的表達。以上結果提示MEG3對于甲狀腺乳頭狀癌是具有抑癌作用的lncRNA，為甲狀腺癌新的治療靶點提供了有效的理論依據，但其具體的分子機制需要進一步探索與證實。

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