影像技術(shù)無創(chuàng)評價小鼠動脈粥樣斑塊模型的研究進展

張 雪，鄭婷婷，彭 佼，陳 蕓（通訊作者）

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院超聲影像科 廣東 深圳 518036）

根據(jù)《中國心血管病報告2018》發(fā)布的數(shù)據(jù)，目前中國有2.9億心血管疾病患者，其死亡率占全國疾病致死因素之首。導(dǎo)致心血管疾病的病因多且復(fù)雜，其中較公認的是血管內(nèi)的粥樣硬化斑塊累積導(dǎo)致血管炎癥，進一步引發(fā)慢性器質(zhì)性病變，最終導(dǎo)致血管硬化，即引發(fā)血管壁粥樣硬化癥，由于病變血管多發(fā)生在動脈，即將這類疾病命名為：動脈粥樣硬化癥（atherosclerosis, AS）[1-3]，本文主要介紹AS斑塊的組織病理學(xué)特征和小鼠AS模型的應(yīng)用，以及各種成像技術(shù)在小鼠AS模型中的診斷評價的最新進展。

1 AS斑塊組織病理學(xué)

AS斑塊顯像的關(guān)鍵在于了解晚期粥樣硬化斑塊的組織病理學(xué)特征。根據(jù)美國心臟協(xié)會（AHA）在1995年制定的動脈粥樣硬化斑塊組織學(xué)分類標準[4]，AS病變可分為以下六型：I型，巨噬細胞和泡沫細胞的沉積；II型，脂肪條紋病變，主要是細胞內(nèi)的脂質(zhì)積聚；III型，斑塊內(nèi)細胞外的脂質(zhì)沉積。這三種類型發(fā)生在斑塊形成早期，通常沒有臨床上的表現(xiàn)[5-6]。IV型，也被稱為粥樣硬化斑形成，是早期AS的臨床表現(xiàn)，其病理學(xué)特征是內(nèi)膜內(nèi)細胞外的脂質(zhì)密集堆積，形成脂質(zhì)核心。在其內(nèi)膜邊緣可看到巨噬細胞、平滑肌細胞和炎癥細胞，同時在斑塊的管腔表面可看到微血管、巨噬細胞、泡沫細胞和淋巴細胞[7]。V型，在脂質(zhì)核心上形成纖維帽。脂質(zhì)核心周圍的毛細血管增生，同時伴有淋巴細胞、巨噬細胞和微出血存在。動脈狹窄就發(fā)生在這個階段。VI型，斑塊破裂，斑塊內(nèi)出血（IPH）和血栓沉積。炎癥和血液動力學(xué)因素導(dǎo)致斑塊破裂，進而導(dǎo)致潰瘍和裂隙[8-9]，正常內(nèi)皮細胞丟失，壞死的脂質(zhì)核心的暴露。而斑塊內(nèi)新生血管的增生、破裂則會導(dǎo)致IPH，極有可能引起血栓形成。這些潰瘍和裂隙可以在血栓周圍重新出血和封閉，形成斑塊內(nèi)血腫和斑塊內(nèi)血栓[10]。當(dāng)這個病變過程反復(fù)出現(xiàn)時，斑塊迅速擴張，狹窄迅速發(fā)展，也增加了遠端血栓栓塞事件的發(fā)生率。

2 小鼠AS模型的應(yīng)用

Apo E-/-小鼠或LDLR-/-小鼠是研究AS最常用、最經(jīng)典的兩個動物模型。正常飲食條件下，Apo E-/-小鼠或LDLR-/-小鼠的血漿膽固醇水平較野生型小鼠的明顯升高，且可自發(fā)產(chǎn)生AS。在高脂飲食誘導(dǎo)下，可加速AS病變的進程，長期誘導(dǎo)甚至出現(xiàn)斑塊破裂，形成血栓。Apo E-/-或LDLR-/-小鼠發(fā)生AS的病變特點是以主動脈流出道最早出現(xiàn)，漸進發(fā)展到主動脈弓部及頭臂干分支，嚴重的病變才會累及腹主動脈[11]。因此，主動脈流出道冷凍切片和主動脈油紅染色分析是目前評價AS嚴重程度的公認標準。

3 小鼠AS模型成像技術(shù)的診斷評價

目前應(yīng)用于小動物動脈粥樣硬化斑塊影像學(xué)評價方法主要有：CT、MRI、PET、超聲成像等。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究團隊致力于納米粒子的研究和多模態(tài)探針的設(shè)計，并結(jié)合生物醫(yī)學(xué)實現(xiàn)疾病模型在分子水平上的成像。

3.1 CT

CT是非侵入性成像冠狀動脈的最佳方式之一，小動物CT對活體小鼠的觀察和測量可高達5um的像素分辨率。通過靜脈內(nèi)注射碘對比劑進行CT血管造影（CT angiography，CTA），可三維顯示顱內(nèi)血管系統(tǒng)。然而，它具有一定的放射性，并且當(dāng)斑塊嚴重鈣化時，將影響圖像的清晰度。利用X射線光譜的多色性可允許所謂的熱點成像，即光譜CT[12]，可鑒別出不同的組織成分，包括組織攜帶的鈣、碘、金等。Cormode及Peter[13-14]等人論證了將金納米顆粒作為有效的細胞標記造影劑用于CT無創(chuàng)成像斑塊內(nèi)單核細胞的可行性。Meester等[15]人也通過動物實驗論證了111In-DANBIRT是一種很有前景的分子成像探針，可用于評估進展性動脈粥樣硬化。

3.2 MRI

MRI是一種強有力的動脈粥樣硬化斑塊形態(tài)學(xué)成像技術(shù)[16]。MRI不使用電離輻射，且在體內(nèi)具有優(yōu)越的空間分辨率[17]。此外，還可以應(yīng)用對比劑來提高MRI檢測的敏感性[18-19]。在小鼠AS模型中，小動物MRI掃描儀在電場強度為7T或更高時，其平面分辨率可達100um[20]。MRI使用多參數(shù)成像協(xié)議表征斑塊組成，通過使用不同的脈沖序列使斑塊各組成結(jié)構(gòu)之間產(chǎn)生對比。多對比度MRI方案通常結(jié)合T1、T2及質(zhì)子密度加權(quán)成像，對血管進行可視化，并可識別典型的斑塊特征，包括血管壁厚度、斑塊內(nèi)出血、斑塊鈣化和纖維帽厚度[21]。但常規(guī)MRI掃描時間較長，不僅影響實驗的操作時間和圖像的即時性，還可能造成高的運動偽影率。MRI對比增強成像有助于區(qū)分斑塊各組分，能選擇性的與斑塊受體結(jié)合的造影劑至關(guān)重要。常見的MRI分子探針包括用氧化鐵或釓（Gd）標記的高密度脂蛋白納米顆粒[22-24]以及與巨噬細胞清除受體相互作用的配體功能化的合成納米顆粒[25]。有文獻指出，CD44是斑塊組織中過度表達的細胞表面蛋白，其水平與斑塊破裂風(fēng)險相關(guān)，并報道了透明質(zhì)酸偶聯(lián)氧化鐵納米粒子可靶向CD44成像[16]。然而，納米顆粒的生產(chǎn)、成本和潛在毒性限制了它們的臨床應(yīng)用。葡聚糖被覆氧化鐵具有良好的生物相容性，且對斑塊巨噬細胞具有固有的親和力[26]，是目前唯一一種被應(yīng)用于臨床的納米顆粒制劑。

3.3 PET

PET成像是基于放射性標記示蹤劑的使用，提供了一種高度敏感的方法來量化多種代謝事件，包括斑塊組成、炎癥、鈣化等。然而，PET的空間分辨率低，需要與具有更好空間分辨率的裝置所攝取的圖像相重疊，如PET/CT和PET/MRI。

18F-FDG是最常見的示蹤劑，與動脈粥樣斑塊中巨噬細胞的浸潤高度相關(guān)，可用于檢測斑塊破壞的重要特征，包括新生血管形成[27]。18F-FDG已被廣泛用于研究小鼠疾病模型中動脈粥樣硬化的發(fā)生、進展和消退。其他放射性示蹤劑包括2-（2-硝基-1h-咪唑-1-?；?n-（2,2,3,3,3-五氟丙基）乙酰胺[（18F）EF5] ，用于定量斑塊密度的低氧標記物[28]。另外，Withana等人[29]證明了以半胱氨酸組織蛋白酶為靶點的活性探針（ABPs）可用于動脈粥樣硬化小鼠模型，利用PET/CT對活化巨噬細胞群進行成像。

PET/CT是在CT掃描后進行PET采集，其顯著局限性與非同步數(shù)據(jù)采集的非同步性有關(guān)[30-32]。CT掃描僅需要幾秒鐘，而PET成像則需較長時間，在兩者進行圖像采集的時間差中，往往由于器官運動和不同的呼吸周期造成重要的人為偽像[33]。此外，CT掃描的輻射風(fēng)險以及對軟組織的對比度降低是應(yīng)用這種多模態(tài)成像技術(shù)的關(guān)鍵問題，與之相比，PET/MRI具有明顯優(yōu)勢。目前，PET/CT仍廣泛應(yīng)用于臨床和動物疾病模型的成像，動脈粥樣硬化的PET/MRI成像還需要進一步研究，特別是，結(jié)合了功能磁共振成像技術(shù)[34]。

PET在動脈粥樣硬化中的其他應(yīng)用還包括通過使用18F-NaF定量斑塊鈣化[35]，以及使用11碳-醋酸酯合成脂肪酸[36]。

3.4 超聲成像

超聲醫(yī)學(xué)是近半個世紀發(fā)展最為迅速的醫(yī)學(xué)影像學(xué)分支，近年來也越來越多的應(yīng)用于小動物疾病模型中病灶的成像，高頻超聲已被證明是監(jiān)測和評估小動物疾病進展和藥理作用的有效工具[37]。

小動物B超圖像主要用于評估斑塊的回聲特性，通常是在病變動脈的縱切面獲取圖像，以便能最大程度顯示斑塊，彩色和功率多普勒能夠進一步描繪出斑塊邊界。B型超聲表征動脈粥樣斑塊的局限性主要是由于觀察者間及觀察者自身的一致性，以及較差的信噪比。采用實時合成技術(shù)，多角度重復(fù)掃描信息相結(jié)合，可提高圖像的信噪比和觀察者的一致性[38]。此外，應(yīng)利用圖像處理技術(shù)以便更好地評估斑塊的回波性[39]。B超評價小動物動脈粥樣硬化疾病的進展不僅可通過直觀的對斑塊成像，還可以通過關(guān)聯(lián)臟器成像的改變來進行早期預(yù)測和評價。Wu J等人[40]的研究確定了高頻超聲診斷設(shè)備在評估高脂飲食誘發(fā)的肝臟疾病和早期動脈粥樣硬化的嚙齒動物模型中的結(jié)果的可靠性。

超聲表征動脈粥樣硬化斑塊的最新進展是在超聲造影（CEUS, contrast enhanced ultrasound）領(lǐng)域。CEUS技術(shù)使用靜脈內(nèi)注入微泡造影劑產(chǎn)生微泡作為血管示蹤劑，以清楚地顯示動脈斑塊的輪廓并提高動脈斑塊的檢出率[41]。因微氣泡只能在血管內(nèi)流動，不會擴散到周圍組織，故超聲造影檢查的所有信號都是血管內(nèi)的，極少出現(xiàn)假性充盈缺損及外溢偽像，它可以彌補彩色多普勒超聲的不足，更準確地反映血管內(nèi)的血流狀況。

超聲造影可清楚地顯示AS斑塊中新生血管形成，通過使用特定脈沖序列抑制組織中的信號并增強微泡的信號，且從造影劑進入到完全消退的整個過程可以被完整記錄下來，實時動態(tài)，使超聲診斷的準確性明顯提高。為了進一步提高超聲測量的再現(xiàn)性，已經(jīng)建立了定量方法，可使用定量分析軟件量化動脈粥樣硬化斑塊超聲造影后的時間-強度變化，獲得斑塊顯影的峰值強度、達峰時間和增強強度等參數(shù)。為評估AS斑塊的穩(wěn)定性提供了一項簡便，準確，無創(chuàng)的檢查方法[42]。

近年來，文獻報道了多種新型納米探針靶向成像小動物AS模型的可行性[43-45]。這些靶向造影劑攜帶特異性抗體或配體，其能夠通過抗原-抗體作用對斑塊表面特異性成像，可提高診斷斑塊新血管形成的準確性。Guo S等人[46]研究制備的靶向微泡可激活血小板上的糖蛋白IIb/IIIa受體，從而檢測和定量AS模型小鼠晚期斑塊表面活化的血小板。

隨著對CEUS技術(shù)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)超聲微泡造影劑不僅是一種良好的超聲成像造影劑，而且是一種重要的藥物輸送載體。超聲介導(dǎo)的靶向微泡給藥（UTMD,ultrasound-targeted microbubble delivery）具有高安全性、高可控性和高效率的優(yōu)點，具有廣闊的應(yīng)用前景。為了進一步增強微泡的靶向性，許多研究致力于設(shè)計新的微泡制備方案。Hong Y等人[47]提出用生物素化的ICAM1抗體（MBi）或生物素化的抗ICAM1抗體和血管生成抑制劑恩度星（endostar）偶聯(lián)（MBie）制備靶向微泡并對Apo E基因敲除的AS模型小鼠進行UTMD治療。

影像技術(shù)通過評估斑塊的組成和定量炎性細胞及炎性過程，可無創(chuàng)監(jiān)測動脈粥樣硬化疾病的進展。在臨床前研究中，已經(jīng)實現(xiàn)了在動物模型體內(nèi)通過納米粒子結(jié)合不同的成像技術(shù)在單細胞水平上追蹤動脈粥樣硬化斑塊中的免疫細胞活動[48]。此外，納米技術(shù)為動脈粥樣硬化靶向治療的發(fā)展提供了創(chuàng)新工具。在未來的研究中，多種成像方式的結(jié)合以及新型納米粒子的制備將會為動脈粥樣硬化疾病的早期診斷及治療提供新思路。