Cr（VI）還原微生物篩選、分離及鑒定

王思雅　左群　劉朝陽　皮海廷　李寧

摘 要：[目標]本文以分離并獲得具有Cr（VI）耐受、還原能力的微生物為目標，[方法]從受污染土壤提取液中富集Cr（Ⅵ）耐受菌株，并對其進行分離、鑒定。[結果]實驗共篩選出四株具有Cr（VI）耐受、還原菌株，其中2株菌株的Cr（VI）耐受能力較好，W1菌株和W3菌株。這兩株菌株均能在鉻濃度為100mg/L的培養液中生存，且具有一定的還原Cr的能力。[意義]這兩株菌株的篩選、分離與鑒定豐富了處理鉻污染微生物的生物資料，對微生物處理重金屬污染具有重大意義。

關鍵詞：鉻污染;耐受菌;篩選;鑒定

Screening，Isolation And Identification of Microorganisms With Chromium Tolerance

Wang Siya1 Zuo Qun2 Liu Chaoyang 1 Pi Haiting2 Li Ning1*

1.School of water conservancy and environment HubeiYichang 443002;

2.College of biology and pharmacy，three gorges university HubeiYichang 443002

Abstract：This paper separation，screening and identification of microorganisms capable of strong resistance to chromium target.By the extract of contaminated soil Cr（Ⅵ）strains screened tolerance，and carries on the separation，Enrichment and detection of PCR.[results]a total of four tolerant strains were screened out in the experiment，but two of them were in poor growth condition，so only the W1 strains and W3 strains with good growth condition were retained.These two strains can survive in the culture solution with chromium concentration of 100mg/L.[Significance]The screening，isolation and identification of these two strains greatly enriched the biological data for treating chromium contaminated microorganisms，which was of great significance for microbial treatment of heavy metal pollution.

Key words：chromium pollution;tolerance;screening;appraisal

如今隨著人們在生產生活中的快速發展，重金屬Cr的污染源逐漸增多，Cr污染土地面積持續擴大，土壤Cr含量也持續增高。[1]調查報告顯示，全國土壤總污染超標率為16.1%，其中Cr（Ⅵ）污染超標率已達1.1%，處于無機污染物點位超標率的前八位，污染范圍較大。[2]

重金屬Cr污染對人類社會有著嚴重的不良影響。土壤中過多的重金屬進入農作物種會富集在農作物中，影響農作物的品質。同時，Cr（Ⅵ）為一種吸入性和吞入性毒物，生物富集性強，可以導致過敏、甚至遺傳性基因受損，是世界癌癥協會確認的重要致癌物質，[3]對人類生命安全有著巨大威脅。因此，Cr污染已經成為急需解決的問題。

近年來，我國土壤重金屬污染問題逐漸顯現，人們對于處理土壤重金屬污染的方法也愈加關注。傳統的Cr處理方法占地面積大、成本高且容易引發二次污染。

目前，有一些 Cr（Ⅵ）還原菌已經被分離出來，如Leucobacter sp.CRBl，可以在 38h 內完全還原 1820mg·L-1的Cr（Ⅵ）。[4]在韓懷芬等進行的實驗中，將5種可以還原 Cr（Ⅵ）的細菌混合后對于Cr（Ⅵ）的處理能力最高能達到100%。[5]同時，微生物法處理Cr污染具有出水水質好、反應溫和并且可以同時處理多種重金屬的優勢，因而越來越受到歡迎。[6，7]使用微生物法處理Cr需要具有強耐Cr性且具有較好的處理Cr功能的微生物菌株。而這些菌群需要我們通過篩選、分離來確定。本實驗利用受到重金屬Cr污染的土壤中獲取的菌群提取液來進行耐Cr菌株的篩選、分離，并進行鑒定、制作系統發育樹。

1 材料與方法

本次實驗所用接種液是通過從受到重金屬Cr污染的土壤中獲取的菌群進行液體培養、并在4攝氏度冰箱保存15天所得，各項生化性質良好。

耐鉻菌株的篩選、分離與純化培養基采用PCS培養基，并在40℃的培養箱中進行篩選，在28℃的培養箱中進行富集培養。

1.1 菌株篩選

用滅過菌的100mL錐形瓶從發酵罐內取得少量發酵液。用無菌水稀釋至10-4、10-5、10-6、10-7。

取一支0.5mL無菌移液管，從濃度小的10-7菌液開始，以10-7、10-6、10-5、10-4為序，分別吸取0.5mL于培養皿內，并做好標記。每次吸取前，使菌液充分混勻。

將已融化并冷卻至50℃左右的培養基倒入培養皿，順時針和逆時針來回轉動培養皿，使培養基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于40℃恒溫培養箱內培養并觀察結果。

1.2 菌株富集

將已經分離得到的單菌株樣本，進行3至4代的傳代培養，至沒有其他雜菌的存在。再進行多批量的劃線培養，生長2到4天后作為菌種保存于冰箱。

1.3 耐Cr菌株的鑒定

觀察篩選菌株的菌落大小、菌落表面以及顏色等形態特征。并對菌株進行革蘭氏染色，確定菌株的革蘭氏陰陽性。最后對菌株進行PCR鑒定，分析其同源性，制作系統發育樹。

2 結果與討論

2.1 菌株的分離

通過使用PCS培養基對菌群中的細菌進行篩選后，我們共獲得了四種對高濃度Cr（VI）離子具有耐受性的菌株。并對獲得的菌株進行分離、富集培養，編號1～4號菌。

2.2 菌株的形態特征

1號菌培養24h后，可在平板上觀察到白色芝麻大小的菌落。72h后，可在平版表面觀察到綠豆大小呈凸出狀的白色不透明菌落。生長狀況良好，易于觀察和取樣。

2號菌培養24h后，可用肉眼觀察到有數量較少的扁平透明的菌落出現。72h后，菌落由扁平透明變為綠豆大小的白色不透明菌落，數量明顯增加。生長狀況良好，易于觀察和取樣。

3號菌培養24h后，難以用肉眼觀察到明顯菌落。48h后，可觀察到有數量較多的呈輻射狀生長的白色透明菌落。72h后，菌落呈黃豆大小的白色透明菌落，菌落邊緣出現褶皺。菌落數量少于1號菌和2號菌，生長狀況一般。

4號菌培養24h后，基本無明顯菌落。48h后可觀察到芝麻大小的白色透明菌落。72h后，菌落數量增加，但菌落大小基本無變化。菌落數量多于3號菌，但少于1號菌和2號菌。

（a）（b）

（c）（d）

a：1號菌平板;b：2號菌平板;c：3號菌平板;d：4號菌平板

圖1 菌株的平板圖

2.2 菌的生長情況預實驗

對菌種的生化特性進行研究前，設置了對比菌種生長狀況的預實驗。將4種細菌分別接種到pH=8.5的含100mg/L Cr（VI）PCS液體培養基內，置于28℃培養箱中進行培養，每24h測定一次細菌濃度。

圖2 菌株的生長狀況

由預實驗可知，1號菌和2號菌生長狀況較好，72h時，最大菌濃可達到0.35以上。而3號菌和4號菌生長狀況一般，96h最大菌濃僅為0.135，表現出3號菌和4號菌對于環境的適應能力較差。故對于生物理化性質的研究及鑒定等僅考慮1號菌和2號菌。

2.3 生物鑒定

對于1號菌和2號菌，抽取總DNA，針對16S rDNA進行進行PCR檢測，所獲得的DNA片段進行測序。測序結果在NCBI上進行BLST，并根據BLST結果利用MEGAX繪制系統發育樹。結果如圖3，1號和2號細菌同屬于Delftia屬微生物，該類微生物的部分菌株在還原重金屬中發揮作用。

圖3 菌株的生長發育樹

3 結論

本實驗通過對菌群的篩選與分離獲得4株耐鉻菌株，并通過觀察單菌生長，選擇對環境適應性較好的1號菌和2號菌作為研究菌株。并將1號菌株和2號菌株分別命名為W1與W3。W1菌和W3菌具有良好的耐鉻性和還原鉻的能力，它們能夠在100mg/L Cr（VI）的培養液中良好生長。耐鉻菌株的分離與發現豐富了處理鉻污染微生物的生物資料，對微生物法處理重金屬污染具有重大意義。

參考文獻：

[1]魏超，等.重金屬污染土壤微生物的分離與研究[J].山西農業科學，2018.46（10）：1691-1694.

[2]劉佳麟，張家銅.土壤重金屬污染的現狀及其治理[J].山東工業技術，2019：229.

[3]楊璐，胡澄.鉻污染水體修復技術研究進展[J].廣西輕工業，2008（07）：96-97.

[4]朱文杰，Leucobacter sp.CRB1菌還原鉻（VI）的機理及其在鉻渣解毒中的應用[M].

[5]韓懷芬.生物法修復鉻污染土攘的研究[J].能源環境保護，2003.17（2）：7-9.

[6]劉玉玲，鐵柏清.鎘污染土壤的微生物修復技術研究進展[J].第六屆重金屬污染防治及風險評價研討會暨重金屬污染防治專業委員會2016年學術年會.中國福建廈門，2016，7.

[7]周啟星，王新.重金屬與土壤微生物的相互作用及污染土壤修復[J].環境污染治理技術與設備，2004.5（11）：1-5.

作者簡介：王思雅（1999-），女，本科，研究方向為環境微生物學。

通訊作者：李寧（1978-），女，副教授，研究方向為環境微生物學。