下調MRP1表達可促進黏液表皮樣癌細胞增殖能力增強

王春芳 王天玨

黏液表皮樣癌（MEC）是頭頸部最常見的原發性涎腺腫瘤［1］，占涎腺惡性腫瘤的35%，高分化黏液表皮樣癌一般為無痛性緩慢生長腫塊，惡性程度不高，但低分化MEC的生長速度快，惡性程度高且常累及周圍神經，屬高度惡性腫瘤，其5年生存率僅有30%［2］。

多藥耐藥相關蛋白（MPR1）一直被認為是一個能量依賴的膜蛋白轉運子，通過轉運化療藥物到細胞外引起腫瘤耐藥，與腫瘤化療的不良預后高度相關［3］。但也有研究發現MRP1通常在成人肝臟中的表達量不可查，但肝損傷后，再生區域的肝細胞中MRP1表達量卻顯著升高［4］，加之MRP1本身也是細胞內許多物質的轉運子，懷疑MRP1表達量的改變是否通過調節細胞內底物的濃度來影響了細胞的生物學特征。

本次研究發現高分化MEC中MRP1高表達，但低分化MEC中的MRP1表達量顯著減少。為研究MRP1在MEC中發揮了什么作用的，利用RNA干擾技術下調MRP1表達，并通過體內和體外實驗驗證了MEC細胞腫瘤生物學特性的改變，為將來MEC的個體化治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 黏液表皮樣癌患者腫瘤樣本

收集北部戰區總醫院和平分院病理科15例高分化MEC和15例低分化MEC患者的組織切片樣本，這些患者均接受了MEC切除術。

1.2 免疫組織化學染色

本研究使用免疫組織熒光的方法來檢測MRP1在MEC腫瘤組織中的表達和定位。樣本固定、包埋，切片（5μm），脫蠟。依據使用說明，使用鏈霉素生物素過氧化物酶檢測試劑盒（北京中山生物技術公司）進行顯色。MRP1鼠抗人單克隆一抗（1∶200；Santa Cruz，Biotechnology公司，USA）孵育過夜。熒光二抗（15μg／ml Affini-Pure羊抗小鼠，北京中山生物技術公司），37℃孵育30 min。DAPI（1μg／ml）襯染細胞核，激光共聚焦顯微鏡（FluoViewTMFV1000；Olympus公司，日本），40倍／1.2光圈觀測。MRP1表達指數根據文獻報道的方法分為1～9分［5］。

1.3 細胞培養

高轉移黏液表皮樣癌細胞系MC3由第四軍醫大學口腔醫院細胞生物教研室贈與。MC3細胞培養在含10%RPMI1640胎牛血清（Gibco BRL）培養基中，內含青霉素和鏈霉素（100 U／ml，Sigma-Aldrich，USA）。

1.4 慢病毒轉染

MRP1 shRNA knockdown利用慢病毒的PLKO ShRNA系統，利用Puromycin進行篩選。MC3細胞種植到6孔細胞培養板，調整細胞密度為40%，上清吸除后，加入病毒液（MOI＝20），4 d后檢測GFP熒光表達情況，把穩定感染慢病毒MRP1-shRNA的細胞記為MC3-S，把穩定感染shRNA陰性對照慢病毒的MC3細胞標記為MC3-NC。

1.5 反轉錄聚合酶鏈反應

使用總RNA提取試劑盒（OMIKA，California，美國）提取細胞總RNA，使用Takara試劑盒（Reverse Transcriptase，Takara，日本）將RNA反轉錄為總cDNA（10μl），待用，反轉錄試劑混合液10 mmol／L，加總RNA模板5μl混合后離心，42℃，15 min；95℃，5 min；4℃，10 min。合成單鏈cDNA作為實時定量PCR的模板，引物序列見表1，GAPDH為內參。實時定量qPCR使用Premix Ex TagTMⅡ試劑盒（Takara），95℃30 s；95℃5 s，56℃34 s，72℃15 s，45個循環。相對表達水平用ΔΔCT顯示。

表1 PCR引物序列及反應條件Tab 1 Primer sequences and PCR conditions

1.6 Western blot

冰浴收集細胞裂解液（50 mmol／L Tris-HCl，150 mmol／L NaCl，50 mmol／L EDTA，1%NonIdet P-40，0.5 mmol／L phenylmethylsulfonyl fluoride，2μg／ml pepstatin A），蛋白定量，蛋白樣本（20μg／ml）用12%分離膠分離，并電轉位（100 V，90 min）至硝酸纖維素膜（Sigma-Aldrich），5%脫脂奶粉封閉，小鼠單克隆抗體（1∶500，Santa Cruz）4℃過夜，IRDyeTM800兔抗小鼠二抗（1∶20 000；Rockland Inc，USA）孵育1.5 h，Odyssey imaging系統（LI-COR Inc.，Lincoln）顯影，β-actin（1∶1 000，Boster公司，USA）用來作為對比內參。

1.7 MTT分析

分別將處于對數生長期的不同組別MC3細胞株接種于96孔板，每孔約3 000個細胞，常規培養24 h后，每天于相應孔中加新鮮配制的MTT溶液（5 g／L）20μl，37℃培養4 h，吸棄孔內上清，每孔加150μL DMSO振蕩（10 min）以溶解結晶；490 nm波長在ELISA儀上測定各孔光吸收值（490 nm）；以每5個重復孔A值的平均數為縱坐標，以時間為橫坐標，繪制細胞生長曲線。

1.8 平板克隆形成實驗

分別將500個細胞接種于100 mm培養皿，每3 d更換一次培養液，培養2～3周，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，20%甲醇固定15 min，Giemsa液染色40 min，用克隆計數儀自動計數，比較不同背景下的細胞克隆形成能力的差異。

1.9 免疫缺陷小鼠的MC3移植瘤模型

選取4～6周齡、體重18～20 g的雄性裸鼠為實驗對象。無菌條件下收獲培養的MEC細胞，PBS調整細胞濃度至5×106／ml，0.1 ml細胞液注射于小鼠背部皮下。待10 d后細胞實體瘤形成，每3 d用游標卡尺測量腫瘤的大小，腫瘤的體積公式：V＝d2×D／2（d：腫瘤的短徑，D：腫瘤的長徑），連續記錄21 d。

1.10 統計學分析

2 結 果

2.1 MRP1在高分化MEC中的表達量顯著高于低分化MEC中的表達量

通過免疫組織熒光對高分化及低分化MEC組織石蠟切片進行染色，并進行評分。結果發現MRP1在所有的黏液表皮樣癌樣本（30／30）中有表達。然而在高分化MEC中，MRP1主要位于細胞膜上，而在低分化MEC中，MRP1主要位于細胞質內，綠色熒光為為MRP1蛋白，藍色為DAPI的細胞核襯染，顯示了MRP1在高分化MEC中和低分化MEC的亞細胞定位：免疫熒光染色可見MRP1主要位于高分化黏液表皮樣癌的細胞膜上且表達量很高，但在低分化黏液表皮樣癌中卻主要位于細胞質中，切表達量明顯較低；（圖1）。而且，統計分析MRP1在組織切片中的表達指數（EI），MRP1在高分化MEC中的表達量（EI＝5.7±1.2）顯著高于MRP1在低分化MEC中的表達量（EI＝1.4±0.3，P＜0.01）（圖2A）。

圖1 MRP1在MEC中的表達 （IHC，×40）Fig 1 MRP1 expression in MEC （IHC，×40）

圖2 MRP1表達量的下調顯著增強了黏液表皮樣癌細胞的生長速度Fig 2 Growth promotion of MEC cells by down-regulation of MRP1 expression

2.2 MRP1 shRNA顯著下調MC3中的MRP1表達

實時定量PCR發現：與MC3-NS細胞對比，MC3-S細胞內MRP1的mRNA表達量顯著下調（N＝3，P＜0.01），值得注意的是，MC3／5FU-S細胞內，MDR1的mRNA表達量也下降了66%±8.5%（P＜0.01）（圖2B）。Western blot驗證了該結果，與MC3-NS細胞相比，MC3-S細胞中的MRP1蛋白表達量也明顯下降（圖2C）。

2.3 下調MRP1后MEC細胞生長速度顯著下降

MTT法檢測MC3-NS細胞和MC3-S細胞的生長速度。從第3天開始，MC3-S細胞的生長速度就開始顯著低于MC3-NS（圖2D）。單克隆形成也顯示MC3-S細胞（31±7）的克隆形成能力就顯著低于MC3-NS細胞（116±14，P＜0.01），單克隆形成實驗顯示MRP1的下調顯著增強了MC3的單克隆形成能力（圖2E）；下調MRP1顯著增加了MC3細胞的體內生長速度（圖2F）。而裸鼠成瘤的體內實驗也顯示MRP1的下調顯著降低的MEC細胞的惡性程度，與MC3-NC組相比（1 186±150）mm3，顯MC3-S組的腫瘤生長速度著降低，腫瘤體積顯著減小（370±41）mm3（P＜0.01）。

3 討 論

MRP1一直被認為是腫瘤產生多藥耐藥的重要蛋白，前期研究也發現MRP1在MEC中高表達，是導致MEC多藥耐藥的重要因素之一，下調MRP1可以顯著降低多種腫瘤細胞的耐藥性，且MRP1的表達與多種腫瘤的化療預后高度相關［6］。但是前期研究發現惡性程度更高的低分化MEC中，MRP1的表達量卻較高分化MEC更少。因此，MRP1可能在黏液表皮樣癌中還發揮著其它作用。

為了驗證相關假設，通過shRNA下調MEC細胞（MC3細胞系）中MRP1的表達，并通過qPCR和Western blot驗證了MRP1的下調水平，發現的是shRNA顯著下調了MC3內的MRP1在轉錄和翻譯水平的表達（P＜0.01）。在下調MRP1表達水平后，通過MTT檢測了MC3細胞的生長曲線，發現MRP1的下調顯著增強了MC3細胞的生長速度；而MC3細胞的單克隆形成實驗也顯示MRP1的下調顯著增強了MC3細胞的單克隆形成能力。體外實驗證實MRP1的下調可通過增強腫瘤細胞增殖能力和克隆形成能力增加腫瘤細胞的惡性程度。為了進一步驗證此結論，將下調MRP1后的MC3細胞（MC3-S）注射于裸鼠皮下，并檢測其生長速率，進一步驗證MRP1的下調可顯著增加了MC3細胞在體內的增殖速率。

實驗結果首次發現MRP1的下調會顯著增強腫瘤細胞在體內和體外的增殖能力和克隆形成能力，雖然大量研究表明，MRP1的下調可顯著降低腫瘤細胞的多藥耐藥性，但本研究解釋了為什么無法通過下調耐藥基因來治愈腫瘤的原因。并未揭示MRP1增加黏液表皮樣癌惡性程度的機制，但有研究發現MRP1是通過調節細胞內谷胱甘肽（GSH）的含量來調節細胞生物學功能的，MRP1是GSH的重要轉運子［7］，而GSH是細胞內的主要抗氧化物質，可減緩細胞衰老并增強細胞生存能力［8］，MRP1的減少可能增加了細胞內GSH的含量，從而減少外源性物質所帶來的傷害，這也許正是無法通過下調耐藥基因來治愈腫瘤的原因。

總而言之，前期研究發現了黏液表皮樣癌細胞中高表達MRP1，但并未解釋MRP1除了作為藥物轉運蛋白之外的細胞機制。本研究進一步完善了MRP1在MEC中相關分子機制，并且我們認為MRP1可作為MEC的新的預后標志物進一步發揮作用，但詳細機制仍需進一步研究。