CD105標記的微血管密度在口腔黏膜良性淋巴組織增生病的表達及與臨床病理特征的相關性

張昊 李荷香 趙亞男 劉慧娟 劉旭倩 侯亞麗

口腔黏膜良性淋巴組織增生病（benign lymphoadenosis of oral mucosa，BLOM）是一種口腔黏膜癌前病變。但由于其臨床表現復雜多樣，誤診率高而被研究者忽視。其病因和發病機制不甚清楚，治療效果不佳。細胞的增殖離不開血管提供的營養，越來越多的證據表明血管生成可能是評估潛在惡性疾病行為的重要因素［1］。微血管密度（microvessel density，MVD）是衡量新生血管生成的一個量化指標。BLOM作為一種癌變率較高的口腔黏膜癌前病變，MVD的表達如何，MVD與BLOM臨床病理關系的研究少有報道。本研究采用免疫組織化學方法檢測CD105標記的MVD在BLOM中表達情況，探討其與臨床病理特征的關系，評價BLOM中新生血管生成活性，為進一步探討其發病機制，尋找理想的治療方法提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 30例BLOM蠟塊均來自河北醫科大學口腔醫院病理科作為BLOM組。15例正常黏膜組織取自腫瘤周圍正常黏膜作為正常對照組。

1.1.2 試劑 CD105單克隆抗體、PV-9000免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學染色法 將BLOM組和正常對照組蠟塊分別切成厚度為3～4μm的切片，常規脫蠟至水，0.01 mol／LPBS沖洗5 min×3次，放入枸櫞酸緩沖液中熱修復，一抗CD105抗體滴度為1∶100，以后按PV9000試劑盒說明書操作，蘇木素復染，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性對照采用已知的陽性組織切片，陰性對照用PBS代替一抗。

1.2.2 MVD計數 分別將BLOM組和正常對照組每張切片在低倍鏡（40倍）下選取CD105染色最密集的部位，高倍鏡（400倍）下計數。凡呈現棕黃色或棕褐色的單個血管內皮細胞或細胞簇（小于3～5個血管內皮細胞），與鄰近結締組織界限明顯者計為一個獨立的微血管。每張切片計數3個高倍視野下微血管數目，取其均值，作為MVD值。MVD計數由2名病理科醫師采用雙盲法完成。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0對數據進行統計學分析。計量資料采用表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05有統計學意義。各組方差齊性時，多個樣本均數間的兩兩比較采用Bonferroni法檢驗，調整檢驗水準為0.017，P＜0.017有統計學意義；若方差不齊時采用Tamhane’s T2法。

2 結 果

2.1 一般情況

BLOM中男性10例（33.3%），平均年齡（56.6±16.8）歲；女性20例（66.7%），平均年齡（57.2±10.8）歲。BLOM病程2～240個月不等，平均病程（21.7±42.9）個月，中位病程12.0個月。30例BLOM患者均無移植宿主疾病、丙型肝炎或艾滋病毒感染；活檢前近6個月均沒有接受過局部或全身治療。15例正常黏膜組織取自腫瘤周圍正常黏膜作為正常對照組。其中男性7例（46.7%），平均年齡（58.9±10.3）歲、女性8例（53.3%），平均年齡（56.4±8.4）歲。

2.2 臨床病理特征

30例BLOM中，發生在頰部23例（76.7%），唇部4例（13.3%），其他部位3例（10%）。糜爛型BLOM 13例（43.3%），臨床主要表現為黏膜糜爛潰瘍；非糜爛型BLOM 11例（36.7%），臨床表現為黏膜白紋或白斑；腫物型BLOM 6例（20%），以鱗狀細胞乳頭狀瘤或纖維上皮息肉為臨床表現。

BLOM在顯微鏡下以淋巴濾泡形成或淋巴細胞灶狀浸潤為特征，本研究30例BLOM組中21例（70%）BLOM黏膜固有層有淋巴濾泡形成，9例（30%）淋巴細胞灶狀浸潤。從炎癥程度［2］上來看，所有BLOM黏膜上皮下均有不同程度的淋巴細胞和漿細胞浸潤，其中輕中度炎癥18例（60%），炎細胞局部小灶狀浸潤或片狀浸潤；重度炎癥12例（40%），炎細胞帶狀或彌漫浸潤。

2.3 免疫組化染色結果

2.3.1 CD105-MVD在BLOM組和正常對照組表達

免疫組織化學染色，CD105定位于血管內皮細胞膜或細胞漿，其陽性微血管呈淺黃色至黃褐色。正常對照組CD105染色陰性（圖1）或弱陽性，CD105-MVD計數無或個別幾個。BLOM組中CD105染色陽性（圖1），高倍鏡下觀察CD105-MVD主要分布于黏膜上皮下緊鄰上皮層或黏膜固有層。2組相比較，BLOM組CD105-MVD計數較正常對照組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 CD105在正常對照和BLOM組的表達Fig 1 Expression of CD105 in normal control and BLOM groups

表1 BLOM組和正常對照組CD105-MVD計數的比較Tab 1 Comparison of CD105-MVD number between BLOM group and normal control group

2.3.2 CD105-MVD計數與BLOM臨床特征的關系

CD105-MVD計數在腫物型、非糜爛型和糜爛型BLOM中依次升高（圖2，表2），差異有統計學意義（P＜0.05）。兩兩比較，CD105-MVD計數僅在腫物型和糜爛型BLOM中有統計學意義（P＜0.001），而在腫物型和非糜爛型BLOM、非糜爛型和糜爛型BLOM中無統計學意義（P＞0.001）。CD105-MVD計數與BLOM年齡、性別、部位和病程無明顯相關性（P＞0.05）。

圖2 CD105在BLOM的表達 （IHC，×200）Fig 2 Expression of CD105 in BLOM （IHC，×200）

表2 CD105-MVD計數與BLOM中臨床特征的關系Tab 2 The relationship between CD105-MVD count and clinical features of BLOM

2.3.3 CD105-MVD計數與BLOM病理特征的關系

CD105-MVD計數在BLOM輕中度炎癥組和重度炎癥組（圖3），其差異有統計學意義（P＜0.05）。CD105-MVD計數和黏膜固有層淋巴濾泡的形成無明顯相關性（P＞0.05）（表3）。

3 討 論

口腔鱗狀細胞癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤。口腔癌的發生要經過以下3個過程：正常黏膜——癌前病變——癌。因此，越來越多的人認為防治口腔癌的有效途徑是有效治療口腔癌前病變，將癌變遏制在萌芽狀態［3］。BLOM是一種癌變率較高的口腔黏膜癌前病變，但發病機制不甚清楚，至今沒有有效的治療方法。因此探討其發病機制，尋找新的治療方法勢在必行。

圖3 CD105在伴炎癥的BLOM中的表達 （IHC，×200）Fig 3 Expression of CD105 in BLOM tissue with inflammation（IHC，×200）

表3 CD105-MVD計數與BLOM病理特征的關系Tab 3 The relationship between CD105-MVD count and pathological features of BLOM

血管生成是腫瘤的標志［4］，是現有血管系統中血管的生長和增殖，這個過程是腫瘤生長、發展和轉移的關鍵因素［5］。評估組織中新生血管的金標準是用特異性內皮細胞標記物如：CD31、CD34、和CD105進行MVD檢測［6］。但CD31、CD34是廣泛內皮細胞標記物，在所有血管內皮細胞均有表達。而CD105僅在活化增殖的血管內皮細胞和胎盤滋養層細胞中高表達，在靜止血管中弱表達或完全不表達［7］。因此，CD105是標記MVD的特異標記物。而且有研究表明應用CD105標記物測定MVD可能是區分癌前病變和癌的一個重要參數［8］，可作為預測患者預后的一個有價值的生物標記物［6］。故本研究采用CD105作為血管內皮細胞標記物，測量其MVD，評估BLOM中新生血管生成活性，為探討BLOM發病機制，尋找新的治療方法提供線索。本研究結果顯示BLOM組CD105-MVD計數較正常對照組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明MVD和BLOM有明顯相關性，在BLOM發生過程中存在明顯的血管生成現象，與李曙霞等［9］研究結果一致。BLOM中明顯的血管生成可能為口腔黏膜上皮細胞的異常增生和惡變提供基礎，有研究者認為新生血管的形成能夠使正常的細胞發生遺傳學改變而惡變，加速癌前病變向癌的轉變［10］。已有研究表明，具有廣泛癌前狀態的口腔黏膜病，如扁平苔蘚［11］、口腔黏膜下纖維化［12］中都有明顯的血管生成現象。因此有研究者認為專注于靶向血管形成的各種治療可以更好地控制潛在惡性疾病向惡性腫瘤的進展［1］為具有惡變潛能的口腔黏膜病的治療提供了新思路。

本研究在對BLOM臨床病理因素如性別、年齡、部位、病程、臨床分型與CD105-MVD計數的分析中發現：CD105-MVD計數與患者年齡、性別、部位、病程無明顯相關性（P＞0.05）。CD105-MVD計數在腫物型、非糜爛型和糜爛型BLOM中依次升高（P＜0.05）。但兩兩比較，CD105-MVD計數僅在腫物型和糜爛型BLOM中有統計學意義（P＜0.001 7）。而在腫物型和非糜爛型BLOM、非糜爛型和糜爛型BLOM中無統計學意義（P＞0.001 7）。推測不同臨床分型的BLOM其發病機制可能不同。BLOM是一種炎癥性疾病，黏膜固有層有不同程度的淋巴細胞和漿細胞浸潤。本研究結果顯示CD105-MVD計數和炎癥程度相關：輕中度炎癥組BLOM CD105-MVD計數明顯低于重度炎癥組，差異有統計學意義（P＜0.05）。推測可能是由于黏膜固有層炎細胞的浸潤刺激口腔黏膜上皮細胞增生，導致缺氧，血管生成增加。增加的血管反過來又可能導致更多淋巴細胞的募集和停留，從而導致炎癥浸潤加重、疾病進展或復發［1］。課題組推測靶向血管形成的各種治療是否可以嘗試應用于BLOM的治療？或者治療BLOM的同時輔以抗炎治療，是否能夠提高BLOM治療效果，有待進一步探討研究。BLOM以黏膜上皮下淋巴濾泡形成或淋巴細胞灶狀聚集為病理特征。本研究結果顯示CD105-MVD計數在黏膜固有層有淋巴濾泡形成組和淋巴細胞灶狀聚集組無統計學意義。說明CD105-MVD計數和淋巴濾泡的形成無明顯相關性，其形成可能是由于細菌、病毒等某種刺激因素刺激黏膜組織形成［13］。

綜上所述，BLOM中有明顯的血管生成現象，CD105可能參與了其中的血管形成，為具有惡變潛能的BLOM治療提供了新思路。