牙周炎伴口腔扁平苔蘚中IL-17激活NF-kB調控hPDLFs促進MMPs的分泌

程鳳峽 孫喜龍 楊玉鵬 許彥枝

牙周炎與口腔扁平苔蘚同為口腔內的高發疾病，具有相互作用、相互影響以及伴隨發生的特征［1-2］。相關炎癥細胞因子在牙周炎伴口腔扁平苔蘚中發揮重要作用［3-6］，IL-17與組織的炎性損傷及自身免疫性疾病的發生有密切關系［7-8］。NF-kB可調節免疫和炎癥反應中大量基因的表達。研究發現，NF-kB與MMPs關系密切，在MMPs基因啟動子近端調控區有特異性NF-kB結合位點，可通過激活NF-kB信號通路促進MMPs升高。牙齦發生炎癥時，齦溝液及唾液中MMPs的活性增加且其酶活性及產物與牙齦炎癥嚴重程度呈正相關。因此，MMP通路是牙周組織破壞的關鍵通路之一。本研究探討IL-17通過激活NF-kB信號通路促進人牙周膜成纖維細胞（hPDLFs）中MMPs的分泌從而影響牙周炎伴口腔扁平苔蘚的病理發生及進程。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取自2016-02～2018-05就診的43例（男性14例，女性29例）牙周炎伴口腔扁平苔蘚患者為研究組，年齡范圍21～67歲，平均年齡（44.1±21.3）歲。選取本院同期體檢的健康志愿者43例為對照組，包括男性18例，女性25例，年齡范圍22～65歲，中位年齡（46.2±18.6）歲，2組患者基線資料比較均無統計學差異（P＞0.05）。

納入標準：①口腔扁平苔蘚患者均需符合《口腔黏膜病學》的診斷標準；②牙周炎患者均需符合國際牙周病新分類慢性牙周炎診斷標準；③入組患者均為口腔扁平苔蘚和牙周炎兩種疾病伴隨發生者；④無全身系統性疾病及慢性疾病；⑤近3個月內未接受過相關藥物治療者。排除標準：①不能確診為口腔扁平苔蘚或牙周炎的患者②單一疾病患者；③哺乳或妊娠期女性；④接受過抗生素等藥物治療者；⑤患有慢性疾病或全身系統性疾病者。

1.2 外周血標本采集

根據入選標準和排除標準篩選合格的入組患者，并抽取納入研究的患者及健康志愿者清晨空腹時的外周靜脈血，采用一次性血清分離膠管，抽取外周靜脈血約3 ml；靜置10 min，待血清析出后，使用臺式離心機以1 000 r／min離心10 min，抽取上層血清，分裝后，保存至-80℃冰箱，備用。

1.3 唾液標本采集

于清晨采用棉簽法采集受試者的唾液標本，在唾液采集前2 h受試者需空腹，不能喝水、喝酒、喝飲料、進食、抽煙、劇烈運動及情緒劇烈波動等。采樣時受試者采取坐位、頭稍前傾體位，采用棉簽蘸檸檬酸刺激口腔唾液分泌，1.5 min后吐出唾液，用10 ml無RNA酶離心管收集唾液標本，立即于4℃，3 000 r／min，15 min離心取上層液體，將收集好的唾液上清凍存于-80℃冰箱，待檢測。

1.4 常規牙周檢查

詳細記錄所有研究對象牙周臨床指標：牙周探診深度（PD）、附著喪失（AL）、菌斑指數（PLI）、牙齦指數（GI）。根據探診深度、牙齦指數、附著喪失、X線片顯示牙槽骨吸收程度來衡量牙周炎的程度。

1.5 hPDLFs細胞培養

取因正畸完整拔除的雙尖牙，常規組織塊法原代培養hPDLFs，并傳代。待第3代細胞貼壁后，將細胞培養基更換為礦化誘導培養基（含去酚紅的DMEM、10%熱非動化胎牛血清、10-8mol地塞米松、10 mmolβ-甘油磷酸鈉、50μg／ml抗壞血酸）。傳代至第4代時，以1.5×104／cm2的密度接種于6孔板中，待細胞融合度達90%后，更換不含血清的礦化誘導培養基，繼續培養12 h后，收集細胞，準備實驗使用。

1.6 ELISA檢測

采用美國eBioscience公司的Human IL-17 Quantikine ELISA Kit，Human MMP-1 Quantikine ELISA Kit，MMP-2 Quantikine ELISA Kit，MMP-3 Quantikine ELISA Kit，MMP-9 Quantikine ELISA Kit分別檢測標本中IL-17的含量，hPDLFs中MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9的含量，實驗操作嚴格遵從試劑盒說明書。

1.7 Western Blot檢測

首先從轉染48 h后的細胞中提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，然后在SDS-聚丙烯酰胺凝膠小孔內添加50μg經過變性處理后的蛋白質，再進行濃縮膠層80 V恒壓一段時間，當樣品在分離膠層壓成一條線時電壓調至120 V，繼續電泳，電泳后于冰上0.25 mA轉膜2 h，麗春紅染色10 min觀察轉移效果，滿意后，TBST緩沖液洗膜后在5%脫脂奶粉與搖床上孵育2 h；加入一抗（1∶500兔抗人p21多抗，1∶5 000兔抗人GAPDH單抗）置于4℃封閉過夜；洗膜后加入羊抗兔IgG／HRP二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，采用增強化學發光法（ECL）顯影得到蛋白印記條帶，用Tanon軟件分析條帶灰度值，相對定量結果以實驗條帶灰度值／β-actin條帶光密度值表示，內參照為β-actin。

1.8 qRT-PCR檢測

應用美國ABI StepOne Plus實時定量PCR儀，嚴格按照日本TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqPCR反應試劑盒的操作說明進行MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，TIMP-1和TIMP-2的RT-PCR檢測。

1.9 CCK8檢測

采用IL-17（10 ng／ml）刺激hPDLFs，設為IL-17處理組；將未經任何處理的hPDLFs設為NC對照組。參照CCK8試劑盒（Invitrogen公司，美國）說明書步驟進行，各組轉染24 h后，接種于96孔培養板，每孔加10μl CCK8，37℃培養2 h，酶標儀上480 nm波長處測定A值，表示細胞增殖能力。

1.10 觀察指標

①對照組、研究組患者血清及齦溝液中IL-17蛋白表達水平；②檢測并記錄研究組患者牙周指標：牙周探診深度（PD）、附著喪失（AL）、菌斑指數（PLI）、牙齦指數（GI）。將研究組患者齦溝液中IL-17表達水平與各牙周指標進行相關性分析；③比較IL-17處理組、NC對照組hPDLFs的CKK8檢測結果，即480 nm波長處的A值；④qRT-PCR法檢測并比較IL-17處理組、NC對照組hPDLFs中MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、TIMP-1、TIMP-2的mRNA表達水平；⑤采用ELISA法檢測并比較IL-17處理組、NC對照組hPDLFs中MMP1、MMP2、MMP3、MMP9的表達水平；⑥預先使用NF-kB的抑制劑PDTC去預處理hPDLFs，然后采用IL-17（10 ng／ml）分別刺激hPDLFs和PDTC預處理的hPDLFs（IL-17+PDTC處理組），12 h后通過Western blot及ELISA檢測并比較NC對照組、IL-17處理組、IL-17+PDTC處理組的P65蛋白磷酸化、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9的表達水平。

1.11 統計學分析

2 結 果

2.1 血清中IL-17蛋白表達水平

ELISA檢測結果示研究組患者血清中IL-17蛋白表達水平為（22.56±2.33）ng／ml，明顯高于對照組血清中IL-17蛋白表達水平（5.50±0.66）ng／ml，差異有統計學意義（t＝46.195，P＝0.000）。

2.2 齦溝液中IL-17的表達水平與臨床牙周指標的相關性

統計結果示研究組PD、AL、PLI、GI均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）。進一步進行相關性分析結果顯示，研究組齦溝液中IL-17的表達水平與各牙周臨床指標均呈顯著正相關（表2）。

表1 2組牙周臨床指標比較 （）Tab 1 Comparison of periodontal clinical indicators between the 2 groups （）

表1 2組牙周臨床指標比較 （）Tab 1 Comparison of periodontal clinical indicators between the 2 groups （）

PLI GI研究組組別 n PD（mm） AL（mm）43 4.21±0.63 2.29±0.45 2.65±0.37 2.36±0.42對照組 43 3.78±0.29 2.09±0.30 2.34±0.19 2.21±0.21 t值 — 4.066 2.425 4.887 2.095 P值 — ＜0.001 0.018 ＜0.001 0.039

表2 齦溝液中IL-17的表達水平與臨床牙周指標的相關性Tab 2 Correlation between the level of IL-17 in gingival sulcus fluid and clinical indicators

2.3 IL-17與hPDLFs增殖能力的相關性

細胞培養24 h后，在480 nm波長處，IL-17處理組A值為（1.876±0.581），NC對照組為（1.693±0.554），組間比較，t＝1.495，P＝0.139。

2.4 IL-17與hPDLFs中MMPs的mRNA表達水平的相關性

IL-17處理組中MMP1、MMP2、MMP3和MMP9的mRNA表達水平高于NC對照組（P＜0.01）（表3）。

表3 2組MMPs的mRNA表達水平比較 （）Tab 3 mRNA expression levels of MMPs in the 2 groups （）

表3 2組MMPs的mRNA表達水平比較 （）Tab 3 mRNA expression levels of MMPs in the 2 groups （）

MMP1 MMP2 MMP3 MMP9 NC對照組 1.000±0.164 1.000±0.122 1.000±0.151 1.000±分 組0.114 IL-17處理組 2.537±0.286 2.082±0.257 1.922±0.136 2.375±0.242 t值 30.571 24.940 29.751 33.706 P值0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 hPDLFs中TIMP-1和TIMP-2的mRNA表達水平

NC對照組與IL-17處理組的hPDLFs中，TIMP-1、TIMP-2 mRNA表達水平無顯著差異（表4）。

2.6 hPDLFs中MMPs蛋白表達水平

IL-17處理組的hPDLFs中，MMPs蛋白的表達水平均明顯高于NC對照組（P＜0.01）（表5）。

2.7 IL-17通過激活NF-kB調節MMPs的表達

ELISA及Western blot檢測發現，與NC對照組比較，IL-17處理組的NF-kB P65蛋白磷酸化的表達水平、MMP1、MMP2、MMP3和MMP9蛋白表達水平均顯著高于NC對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。IL-17+PDTC處理組的NF-kB P65蛋白磷酸化的表達水平、MMP1、MMP2、MMP3和MMP9蛋白的表達水平均顯著低于IL-17處理組，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖1）。

表4 2組hPDLFs中TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表達（）Tab 4 mRNA expression levels of TIMP-1 and TIMP-2 in hPDLFs of the 2 groups （）

表4 2組hPDLFs中TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表達（）Tab 4 mRNA expression levels of TIMP-1 and TIMP-2 in hPDLFs of the 2 groups （）

分 組1.000±0.149 1.000±0.125 IL-17處理組 0.863±0.964 0.937±0.312 t值 0.921 1.229 P值TIMP-1 TIMP-2 NC對照組0.360 0.223

表5 2組MMPs蛋白表達水平比較 （pg／ml，）Tab 5 Proteins expression of MMPs in the 2 groups （pg／ml，）

表5 2組MMPs蛋白表達水平比較 （pg／ml，）Tab 5 Proteins expression of MMPs in the 2 groups （pg／ml，）

MMP1 MMP2 MMP3 MMP9 NC對照組 75.05±8.16 151.40±16.22 35.30±4.11 105.36±分 組10.14 IL-17處理組 166.37±17.28 256.78±30.57 131.44±15.16 215.37±23.24 t值 31.336 19.968 40.136 28.450 P值0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 IL-17通過激活NF-kB調節MMPs的表達Fig 1 Il-17 regulates the expression of MMPs by activating NF-kB

3 討 論

TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8等炎癥細胞因子在牙周疾病的發展進程中起著重要作用，與牙周炎及口腔扁平苔蘚的發生發展關系密切。但IL-17與牙周炎伴口腔扁平苔蘚的關系目前尚不明確。IL-17是一種復雜的多功能細胞因子，能夠促進T細胞和NK細胞產生IFN-γ，增強Fas-FasL系統介導的細胞毒作用，調節促進Th1細胞發育分化，促進Th1細胞分泌多種細胞因子。有報道示IL-17能促進炎癥因子和趨化因子的表達，進而發展成各種炎癥性疾病。IL-17與相應IL-17R結合后，通過p38MAPK和JNK信號通路可誘導AP-1，NF-KB等轉錄基因表達，多種轉錄基因的表達增強，促進下游IL-6，IL-8等炎癥細胞因子表達加強。許多免疫細胞包括單核細胞，巨噬細胞等都受IL-17的調控，因此，IL-17在炎癥反應鏈中扮演著重要的角色。本研究中，與健康志愿者相比，牙周炎伴口腔扁平苔蘚患者血清中IL-17蛋白表達水平升高，提示IL-17可能與牙周炎伴口腔扁平苔蘚存在相關性。牙周炎伴口腔扁平苔蘚患者唾液中IL-17的表達量與菌牙周探診深度、附著喪失、菌斑指數、牙齦指數這些臨床指標呈正相關，表示IL-17可能促進牙周破壞程度。

hPDLFs是牙周組織中的主要細胞成分，具有趨化，增生，黏附，分化為成牙骨質細胞，成骨細胞，形成礦化組織等功能。本研究發現，IL-17與hPDLFs的增殖能力無明顯相關性，說明IL-17并不是通過影響hPDLFs的增殖而參與到牙周炎伴口腔扁平苔蘚的發展過程。

MMPs在牙周組織破損過程中起著關鍵作用，其中MMP-1是膠原酶，可降解Ⅰ～Ⅲ型膠原及其他ECM，在病變的牙周組織中高表達；MMP-2是明膠酶，可降解明膠及Ⅰ～Ⅲ型膠原，在牙周組織破壞過程中發揮關鍵作用，調控牙周組織炎癥過程；而另一種明膠酶MMP-9可降解明膠、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅶ型及Ⅹ型膠原，MMP-9的表達與牙周炎伴口腔扁平苔蘚患者牙周組織破壞程度密切相關［9-11］。MMP-3是基質溶解素，可激活其他MMPs，促進炎癥進程。相關研究表明，在牙周炎患者患病部位的齦溝液中，MMP-3和MMP-1含量明顯增加，并與患者臨床癥狀密切相關。研究發現，MMPs功能活性可以被TIMPs調節，在炎性牙周組織中，MMPs含量高于TIMPs，炎癥程度越重，活性MMPs濃度越高［12］。與健康人群相比，牙周炎伴口腔扁平苔蘚患者齦溝液及牙齦組織中MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9顯著升高，而TIMP-1和TIMP-2顯著降低［13-14］。本研究發現，IL-17可以促進hPDLFs中MMP1，MMP2，MMP3和MMP9的mRNA表達，但值得注意的是，IL-17不會對TIMP-1和TIMP-2的mRNA表達產生明顯影響。IL-17可促進hPDLFs中MMP1，MMP2，MMP3和MMP9蛋白的分泌。表明IL-17可能通過上調MMP1，MMP2，MMP3和MMP9的表達從而促進牙周炎伴口腔扁平苔蘚患者的病理發展。

NF-kB可調控IL-2，IL-6，IL-8，TNF-α，MMPs，GCSF等一系列細胞因子，是許多免疫炎癥相關基因轉錄調控的樞紐，通過影響NF-KB的活性有可能直接調控機體的免疫狀態。NF-kB和MMP-1有緊密的聯系，MMP-1的基因啟動子區域包含NF-kB的結合位點，NF-kB和位點結合后，啟動MMP-1的基因轉錄，參與蛋白的表達。MMP-9有一個NF-kB的結合位點，阻斷NF-kB信號通路可以下調MMP-9的表達。本研究發現，IL-17刺激后，NF-kB P65蛋白磷酸化的表達水平明顯降低，MMP1，MMP2，MMP3和MMP9蛋白的表達水平受到抑制。表明IL-17可激活NF-kB信號通路，誘導MMP1，MMP2，MMP3和MMP9的表達量升高。

綜上所述，IL-17在牙周炎伴口腔扁平苔蘚患者的病理進程中扮演了重要角色，本研究數據表明，IL-17可通過激活NF-kB信號通路，使活化的NF-kB促進hPDLFs中的MMP1，MMP2，MMP3和MMP9的分泌，從而起到促進牙周炎伴口腔扁平苔蘚的發展。因此，IL-17可能為牙周炎伴口腔扁平苔蘚的診斷及治療提供了新的研究方向與治療靶點。