辛伐他汀-膠原蛋白海綿用于大鼠直接蓋髓后牙髓中VEGF、BMP-2的表達(dá)

關(guān)為群 張楊安 李群 劉玲玲

牙髓是位于牙髓腔內(nèi)疏松的結(jié)締組織，其對(duì)外來(lái)刺激能產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)。對(duì)于外傷、齲病、機(jī)械性露髓的患牙，希望通過(guò)有效的蓋髓材料覆蓋于牙髓的暴露處，以消除感染、充分調(diào)動(dòng)牙髓組織的再生修復(fù)能力，從而促進(jìn)牙髓愈合，保存牙髓活力。研究發(fā)現(xiàn)，在牙髓損傷愈合的過(guò)程中有眾多的細(xì)胞因子參與如FGF-2、BMPs、VEGF等［1-2］，這些細(xì)胞因子在促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖、分化以及修復(fù)性牙本質(zhì)形成方面起著重要的作用［3-4］。

辛伐他汀是臨床上治療膽固醇高血脂癥、動(dòng)脈粥樣硬化的一線藥物。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)辛伐他汀除了降低血脂的作用外還具有促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖和分化，血管再生，抵抗炎癥反應(yīng)等作用。本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)辛伐他汀對(duì)牙髓細(xì)胞增殖和分化具有積極的作用［5］，因此本研究將進(jìn)一步體內(nèi)檢測(cè)辛伐他汀直接蓋髓術(shù)后牙髓組織VEGF及BMP-2的表達(dá)情況，對(duì)辛伐他汀促進(jìn)牙髓細(xì)胞損傷后修復(fù)機(jī)制進(jìn)行初步的探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

8周齡成年雄性SD大鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）120只，清潔級(jí)，體重（200±5）g，口腔衛(wèi)生狀況良好，無(wú)齲齒及牙周疾病。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將上述的120只大鼠分為3組，即辛伐他汀-膠原蛋白海綿組（SIM組）、膠原蛋白海綿組（CS組）及氫氧化鈣組（CH組），每組40只。每只大鼠左上頜第一磨牙為實(shí)驗(yàn)牙，并設(shè)對(duì)側(cè)上頜第一磨牙為正常對(duì)照牙。

1.2 主要的試劑與材料

辛伐他汀（Sigma，美國(guó)）；Ca（OH）2（上海二醫(yī)張江生物材料有限公司）；膠原蛋白溶液（北京科勞得生物制品技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DG16探針（北京鑫興嘉業(yè)商貿(mào)有限公司）；玻璃離子（富士公司，日本）。VEGF兔多克隆抗體及BMP-2兔多克隆抗體（Abcam公司，英國(guó)）；ElivisionTMplus免疫組化試劑盒及DAB顯色劑（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。

1.3 辛伐他汀-膠原蛋白復(fù)合海綿的制備

準(zhǔn)確稱取25 mg辛伐他汀將其溶解在0.2 ml的無(wú)水乙醇中，然后加入濃度為0.2 mol／L的氫氧化鈉0.3 ml，在50℃下加熱2 h后，用1 N鹽酸中和到pH為7.2，用 PBS定容至1 ml，終濃度為60 mmol／L作為母液，4℃下儲(chǔ)存，使用前取母液1.67μl，加入到100 ml的膠原蛋白溶液中，磁力攪拌器下攪拌均勻，終濃度為1μmol／L，將攪拌均勻的混合液倒入六孔板中，并置于-80℃冰箱中冷凍12 h，隨后轉(zhuǎn)入到冷凍干燥機(jī)中在抽真空的狀態(tài)下冷凍干燥24 h，即得到辛伐他汀-膠原蛋白復(fù)合海綿。在無(wú)菌操作臺(tái)上將復(fù)合物剪成0.5 mm3的小塊，經(jīng)60Co輻照滅菌處理后放于4℃冰箱中冷藏保存、備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立

按3 ml／kg的劑量于大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，取仰臥位將其固定在手術(shù)臺(tái)上，3%過(guò)氧化氫和生理鹽水交替沖洗口腔，用0.5%的碘伏消毒口腔及其周圍組織，用1／4號(hào)球鉆在用水冷卻的條件下于左上頜第一磨牙的咬合面中央窩處間斷鉆磨，直至窩洞底透出粉紅色，隨后換用DG16探針輕輕穿髓，穿髓孔的直徑為0.35 mm，以見(jiàn)到輕微出血點(diǎn)作為穿髓成功的標(biāo)準(zhǔn)。生理鹽水沖洗窩洞，無(wú)菌小棉球除去多余水分。分別將制備好的氫氧化鈣、辛伐他汀-膠原蛋白復(fù)合海綿以及膠原蛋白海綿覆蓋于穿髓孔處，盡量不向髓腔方向加壓，嚴(yán)密封閉穿髓孔，玻璃離子充填，適當(dāng)降低雙側(cè)下頜第一磨牙，整個(gè)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照無(wú)菌操作進(jìn)行。術(shù)后第1、3、7、14、28天各組隨機(jī)選取8只，采用心臟灌注的方法處死大鼠，迅速分離出含有第一磨牙的上頜骨，立即置于4%多聚甲醛中繼續(xù)體外固定48 h。

1.5 組織標(biāo)本的制備及免疫組化染色

將固定好的標(biāo)本放入10%的EDTA（pH＝7.4）溶液中，25℃恒溫下進(jìn)行脫鈣，脫鈣時(shí)間為12周，流水沖洗12 h，去除玻璃離子，梯度乙醇脫水，正丁醇透明，浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，制作平行于牙體長(zhǎng)軸方向做近遠(yuǎn)中向連續(xù)切片，厚度為4μm，用于免疫組化染色。采用Elivision方法進(jìn)行免疫組化染色。所用VEGF抗體濃度為1∶600，BMP-2抗體濃度為1∶300，均設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.6 結(jié)果判斷和圖像分析

結(jié)果判斷：VEGF陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中，而B(niǎo)MP-2陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈清晰棕色或棕褐色為陽(yáng)性。以染色深淺作為陽(yáng)性強(qiáng)度的判定標(biāo)準(zhǔn)，強(qiáng)陽(yáng)性、陽(yáng)性、弱陽(yáng)性、陰性表達(dá)分別為深棕黃色、棕黃色、淺黃色、無(wú)著色。

圖像分析：隨機(jī)選取通過(guò)穿髓孔且冠根完整的切片，每組各5張，在高倍鏡下，隨機(jī)選3個(gè)不重復(fù)的陽(yáng)性區(qū)域，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)量其平均吸光度值（A值），并取均值，數(shù)據(jù)用表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，若資料服從正態(tài)分布且方差齊同，則對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組先進(jìn)行單因素方差分析（one-factor ANOVA），若結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩分析；此外，各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)與正常對(duì)照之間采用Dunnett-t檢驗(yàn)，若資料非正態(tài)分布或（和）方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)。按α＝0.05水準(zhǔn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 VEGF、BMP-2正常牙髓組織中的表達(dá)情況

在正常的牙髓組織中VEGF在血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)，而牙髓細(xì)胞及成牙本質(zhì)細(xì)胞則無(wú)表達(dá)。而B(niǎo)MP-2在正常的牙髓組織中均未出現(xiàn)表達(dá)，呈陰性表達(dá)（圖1）。

2.2 VEGF在實(shí)驗(yàn)組牙髓組織中的表達(dá)情況

圖1 VEGF、BMP-2在正常牙髓組織中的表達(dá)情況Fig 1 VEGF and BMP-2 expression in normal dental pulp tissue

圖2 VEGF在實(shí)驗(yàn)組牙髓組織中的表達(dá)情況 （×400）Fig 2 VEGF expression in experimental dental pulp tissue （×400）

圖2示，術(shù)后第1天：穿髓點(diǎn)下方血管輕度擴(kuò)張，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)中出現(xiàn)著色呈陽(yáng)性表達(dá)，中性粒細(xì)胞弱表達(dá)，成牙本質(zhì)細(xì)胞則無(wú)表達(dá)。術(shù)后第3天：中性粒細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞都呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，血管擴(kuò)張、增生，成牙本質(zhì)細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，成纖維細(xì)胞表達(dá)數(shù)量增多，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。術(shù)后第7天：血管增生，內(nèi)皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，新分化的成牙本質(zhì)樣細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，成纖維細(xì)胞增殖區(qū)呈陽(yáng)性表達(dá)。術(shù)后第14天：血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)減弱，呈陽(yáng)性表達(dá)，成牙本質(zhì)細(xì)胞弱陽(yáng)性表達(dá)，新形成的修復(fù)性牙本質(zhì)下方排列較為整齊的成牙本質(zhì)樣細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá)。術(shù)后第28天：實(shí)驗(yàn)組表達(dá)情況與正常對(duì)照組的相似，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，而成牙本質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞均呈陰性表達(dá)。

2.3 BMP-2在實(shí)驗(yàn)組牙髓組織中的表達(dá)情況

圖3示，術(shù)后第1天：穿髓孔周圍的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，少量的成纖維細(xì)胞出現(xiàn)表達(dá)呈弱陽(yáng)性，而成牙本質(zhì)細(xì)胞則無(wú)表達(dá)。術(shù)后第3天：血管內(nèi)皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，成纖維細(xì)胞表達(dá)數(shù)量增加以及浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞都呈陽(yáng)性表達(dá)，成牙本質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)呈弱陽(yáng)性。術(shù)后第7天：穿髓孔下方及周圍的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，成纖維細(xì)胞及成牙本質(zhì)細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，新生的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)。術(shù)后第14天：成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞以及兩側(cè)成牙本質(zhì)細(xì)胞表達(dá)均有所減弱，血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)。術(shù)后第28天：牙髓組織恢復(fù)正常，基本檢測(cè)不到BMP-2的表達(dá)。

2.4 圖像分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖3 BMP-2在實(shí)驗(yàn)組牙髓組織中的表達(dá)情況 （×400）Fig 3 BMP-2 expression in experimental dental pulp tissue （×400）

表1 3組蓋髓術(shù)后VEGF陽(yáng)性染色A值 （）Tab 1 A value of VEGF positive staining of three direct pulp capping groups （）

表1 3組蓋髓術(shù)后VEGF陽(yáng)性染色A值 （）Tab 1 A value of VEGF positive staining of three direct pulp capping groups （）

注：①與正常對(duì)照相比，P＜0.05；②與CS組相比，P＜0.05；③與CH組相比，P＜0.05

時(shí)間（d） CS組 CH組 SIM組1 0.014 93±0.001 65① 0.019 34±0.002 06①② 0.021 02±0.002 15①②.000 29 0.036 73±0.002 81① 0.049 58±0.003 30①② 0.066 39±0.003 53①②③7 0.025 15±0.003 02① 0.035 67±0.002 38①② 0.043 56±0.003 22①②③14 0.011 65±0.001 40① 0.012 83±0.001 18① 0.013 16±0.001 82①28 0.001 81±0.000 20 0.001 96±0.000 35 0.002 01±0.000 28正常對(duì)照 0.001 75±0.000 29 0.001 75±0.000 29 0.001 75±0 3

表2 3組蓋髓術(shù)后BMP-2陽(yáng)性染色A值 （）Tab 2 A value of BMP-2 positive staining of three direct pulp capping groups （）

表2 3組蓋髓術(shù)后BMP-2陽(yáng)性染色A值 （）Tab 2 A value of BMP-2 positive staining of three direct pulp capping groups （）

注：①與正常對(duì)照相比，P＜0.05；②與CS組相比，P＜0.05；③與CH組相比，P＜0.05

時(shí)間（d） CS組 CH組 SIM組1 0.005 27±0.000 95① 0.005 63±0.001 12① 0.006 01±0.000 99①.000 20 0.012 39±0.001 50① 0.017 38±0.002 52①② 0.021 81±0.001 94①②7 0.034 11±0.002 81① 0.046 58±0.003 22①② 0.064 59±0.003 88①②③14 0.024 93±0.003 02① 0.034 98±0.002 85①② 0.042 09±0.003 32①②③28 0.000 68±0.000 15 0.000 74±0.000 19 0.000 81±0.000 18正常對(duì)照 0.000 63±0.000 20 0.000 63±0.000 20 0.000 63±0 3

正常對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組蓋髓術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)，VEGF、BMP-2陽(yáng)性染色的平均光密度值如表1～2。實(shí)驗(yàn)組中VEGF、BMP-2的表達(dá)強(qiáng)度都呈現(xiàn)出先升高后降低的變化，VEGF在術(shù)后第3天達(dá)到峰值，而B(niǎo)MP-2在術(shù)后第7天達(dá)到最大值。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，3組實(shí)驗(yàn)組VEGF、BMP-2在術(shù)后第1、3、7、14天的表達(dá)水平要高于正常對(duì)照組（P＜0.05），但在術(shù)后第28天表達(dá)水平則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SIM組及CH組中VEGF的表達(dá)量在術(shù)后第1、3、7天顯著高于CS組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），此外，與CH組相比，SIM組在術(shù)后第3、7天，VEGF的表達(dá)水平更高（P＜0.05）。術(shù)后第3、7、14天SIM組及CH組BMP-2的表達(dá)強(qiáng)度要高于CS組（P＜0.05），而SIM組與CH組則在術(shù)后第7、14天表達(dá)存在顯著差異，SIM組BMP-2表達(dá)要高于CH組（P＜0.05）。

3 討 論

血管生成是所有傷口愈合的關(guān)鍵步驟，同樣牙髓血管生成也是牙齒修復(fù)的前提條件［6］。血管生成是一個(gè)多步驟的動(dòng)態(tài)過(guò)程，有眾多的細(xì)胞因子參與其中，而VEGF作為血管生成最為重要的調(diào)節(jié)因子之一，在血管的生成中具有重要的促進(jìn)作用［7］。

研究發(fā)現(xiàn)，VEGF不僅能促進(jìn)牙髓組織血管的形成，而且還參與了牙髓炎癥的發(fā)展以及牙髓組織損傷后修復(fù)的過(guò)程中［8］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明在正常的牙髓組織中，VEGF有少量的表達(dá)，表明其可能參與了正常牙髓的生理過(guò)程。而且在直接蓋髓術(shù)后第1～14天，實(shí)驗(yàn)組VEGF的表達(dá)水平均高于正常組，且VEGF表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞由起先血管內(nèi)皮細(xì)胞到術(shù)后炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)陽(yáng)性，同時(shí)這一時(shí)間范圍內(nèi)是牙髓組織炎癥反應(yīng)及損傷修復(fù)的過(guò)程，說(shuō)明VEGF在這一過(guò)程中起著一定的作用。VEGF參與牙髓炎癥反應(yīng)主要與其能上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性、增加血管的通透性，以及促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞的游走、趨化、聚集于損傷的部位有關(guān)［9-10］。此外，VEGF還可通過(guò)誘導(dǎo)牙髓血管形成，為損傷組織提供充足的血供和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖、成骨分化、提高ALP的表達(dá)水平參與牙髓的修復(fù)［11］。VEGF促進(jìn)炎癥反應(yīng)以及誘導(dǎo)牙髓血管生成、牙髓細(xì)胞增殖分化在一定程度上都有利于損傷牙髓的恢復(fù)。

本研究中，在蓋髓術(shù)后1～14 d，SIM組VEGF的表達(dá)量要高于CS組及CH組，可知辛伐他汀具有促進(jìn)牙髓組織VEGF的表達(dá)，而且其促進(jìn)VEGF的表達(dá)能力要強(qiáng)于氫氧化鈣。研究表明辛伐他汀能夠促進(jìn)包括牙髓細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)［12］，其促進(jìn)牙髓細(xì)胞VEGF的表達(dá)可能與提高血紅素加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）的表達(dá)水平有關(guān)［13］。研究發(fā)現(xiàn)其還能通過(guò)提高VEGF的表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)糖尿病患者傷口的愈合以及去卵巢大鼠種植體周圍骨組織的生成［14-15］。表明辛伐他汀可能通過(guò)提高牙髓組織VEGF的表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)受損牙髓組織的修復(fù)。

牙髓愈合的過(guò)程中，除了需要新生的血管為其提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還需要有能夠促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成的細(xì)胞因子，而B(niǎo)MP-2在這一過(guò)程中起著重要的作用。早期的研究已證實(shí)BMP-2的表達(dá)從牙胚發(fā)育一直持續(xù)到成牙本質(zhì)細(xì)胞分化完成；而且，在成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌的牙本質(zhì)基質(zhì)時(shí)BMP-2出現(xiàn)了表達(dá)上調(diào)［3］；此外，有學(xué)者將BMP-2應(yīng)用于直接蓋髓術(shù)后，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成［2］。這些都表明BMP-2在牙胚發(fā)育、成牙本質(zhì)細(xì)胞分化以及牙本質(zhì)形成方面扮演著十分重要的角色。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蓋髓術(shù)后第7天，牙髓炎癥程度減輕、修復(fù)性牙本質(zhì)開(kāi)始形成時(shí)，BMP-2的表達(dá)達(dá)到了最大值，此時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞都呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而這一陽(yáng)性表達(dá)一直持續(xù)到完整的修復(fù)性牙本質(zhì)形成，表明BMP-2在牙髓損傷修復(fù)階段能夠促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。在蓋髓術(shù)后1～14 d，SIM組BMP-2的表達(dá)強(qiáng)度要高于CS組，可知辛伐他汀-膠原蛋白復(fù)合海綿中促進(jìn)牙髓損傷修復(fù)過(guò)程中BMP-2表達(dá)的主要成分是辛伐他汀。研究表明辛伐他汀在多種成骨細(xì)胞系及骨組織的愈合過(guò)程中均能提高BMP-2的表達(dá)水平［16］。其促進(jìn)BMP-2的表達(dá)與其能抑制HMG-CoA還原酶和Rho（rhodostomin）相關(guān)激酶的活性，以及促進(jìn)核結(jié)合因子al（core binding factors alpha 1，Cbfa1）的表達(dá)有關(guān)［17］。此外，在蓋髓術(shù)后1～14 d，CH組BMP-2的表達(dá)水平要低于SIM組，可能與氫氧化鈣的強(qiáng)堿性引起牙髓組織凝固壞死有關(guān)，研究表明將氫氧化鈣與大鼠牙髓細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)，牙髓細(xì)胞BMP-2表達(dá)水平出現(xiàn)降低［18］，這也說(shuō)明氫氧化鈣的細(xì)胞毒性影響了牙髓細(xì)胞BMP-2的表達(dá)。

綜上所述，辛伐他汀-膠原蛋白復(fù)合海綿促進(jìn)牙髓組織愈合以及修復(fù)性牙本質(zhì)的形成與其能顯著提高牙髓損傷修復(fù)的過(guò)程中VEGF及BMP-2的表達(dá)水平有關(guān)。