胰腺癌中磷脂酶Cε1和B淋巴細(xì)胞瘤-2表達(dá)的研究

徐懿，宋堃

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院1.眼科；2.普通外科，湖南長沙410008）

胰腺癌作為消化道腫瘤中致死率極高的腫瘤之一，在癌癥人數(shù)中排名第四位［1］。胰腺癌的危險(xiǎn)因素很多；由于其起病隱蔽，患者在早期因無癥狀鮮少于醫(yī)院就診，使胰腺癌早期檢出率極低。雖然經(jīng)過多年的基礎(chǔ)與臨床研究，但晚期胰腺癌的預(yù)后仍然差強(qiáng)人意。

PLCε1 作為磷脂酶C（phospholipase C, PLC）蛋白家族中的不可忽視的部分，對(duì)于磷酸肌醇為基礎(chǔ)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有不可或缺的作用。研究證實(shí)PLCε1 參與磷酸肌醇信號(hào)通路的調(diào)控，水解磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate, PIP2）后生成三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3）和二酰甘油（diacyl glycerol,DAG），二者作為細(xì)胞信使參與信號(hào)通路和相關(guān)細(xì)胞機(jī)制的調(diào)節(jié)［2］。同時(shí)，PLCε1 可通過IP3活化鈣離子通路信號(hào)，并在生成DAG 后激活蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）從而進(jìn)一步參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、應(yīng)激和凋亡。凋亡機(jī)制在器官成熟、人體發(fā)育的過程中有非凡的意義［3］。凋亡是機(jī)體清除腫瘤的一種重要方式。凋亡機(jī)制受到眾多基因、蛋白、micRNA 的調(diào)控，該機(jī)制的平衡被打破，如促進(jìn)腫瘤凋亡可以抑制腫瘤生長，反之則誘發(fā)腫瘤產(chǎn)生。針對(duì)凋亡機(jī)制相關(guān)的調(diào)控基因，人們已經(jīng)展開了對(duì)B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）家族基因的許多研究，而Bcl-2 是抑制凋亡的重要蛋白［4］。Bcl-2 主要參與線粒體凋亡途徑（內(nèi)源性凋亡途徑）的調(diào)控，抑制凋亡［5］。凋亡的始動(dòng)分子BAK、BAX 是BH3 結(jié)構(gòu)域蛋白的效應(yīng)分子。BAK、BAX 引起線粒體外膜構(gòu)象變化，是啟動(dòng)凋亡的重要步驟，而Bcl-2 可以有效地抑制二者的活性［6］。Bcl-2 從被發(fā)現(xiàn)起，在腫瘤中它的過表達(dá)都預(yù)示著不良的預(yù)后。PLCε1 對(duì)鈣離子信號(hào)-凋亡通路的調(diào)節(jié)有重要作用，可能與Bcl-2 在凋亡的調(diào)控上存在交集，相互影響。

近年的多項(xiàng)研究認(rèn)為PLCε1 與多種腫瘤有關(guān)，這讓PLCε1 逐漸成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注并感興趣的一個(gè)研究領(lǐng)域。這些研究發(fā)現(xiàn)PLCε1 通過多途徑、多通路在惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程中扮演重要角色。PLCε1 在食管癌組織中的高表達(dá)可能與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤進(jìn)展有關(guān)聯(lián)［7］。ZHAI 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，使用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除PLCE1 基因，能降低胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄因子snail 的水平從而抑制細(xì)胞遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）發(fā)生。在對(duì)PLCε1 的不斷研究中，眾多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，PLCε1 基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌、食管癌、胃癌多種惡性腫瘤罹患風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，并且影響其發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后［9-11］。ras 基因?qū)τ谝认侔┣橛歇?dú)鐘，有研究證明超過80%的這種惡性腫瘤存在K-ras 突變［12］。PLCε1 與ras 基因的關(guān)系十分密切，與ras 家族成員有雙向作用。PLCε1 含有特異性的RA 區(qū)（Ras-associating domains），可與ras 家族的多種蛋白相結(jié)合。PLCε1 又被認(rèn)為是ras 家族的直接下游效應(yīng)分子之一［13］。因此，PLCε1或許也參與對(duì)胰腺癌的調(diào)控。

在PLCε1 被研究證實(shí)可能成為腫瘤預(yù)防治療潛在靶點(diǎn)的同時(shí)，眾多學(xué)者還發(fā)現(xiàn)PLCε1 可以通過上調(diào)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、白細(xì)胞介素4（IL-4）等多種炎癥因子促進(jìn)炎癥風(fēng)暴。在缺血再灌注小鼠模型中檢測到PLCε1 表達(dá)增加，通過NF-κB 影響下游IL-6、TNF-α、IL-1 等多種炎癥因子的表達(dá)，加重再灌注時(shí)的心肌損害［14］。研究提示血管生成是癌變和腫瘤增殖等病理生理過程中不可或缺的部分，絕大多數(shù)新生血管病理過程與炎癥有關(guān)［15］。

由此看來，PLCε1 對(duì)ras、腫瘤有重要調(diào)節(jié)作用，與Bcl-2 在凋亡機(jī)制調(diào)節(jié)中可能有共同的通路或調(diào)節(jié)機(jī)制。可是在胰腺癌的研究中鮮有關(guān)于PLCε1 的報(bào)道，PLCε1 在胰腺癌中具體作用、相關(guān)機(jī)制都不明確，所以筆者嘗試從PLCε1 的表達(dá)入手，探索它和胰腺癌潛在的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器

可調(diào)溫烤箱DHP060 型（上海）；光學(xué)顯微鏡102 型（Olympus 公司）；冰箱（西門子公司）；可調(diào)微量移液器（Eppendorf 公司）。組化試劑盒（KIT-5020，羊抗鼠/兔，福州邁新公司）；一抗：兔抗人PLCε1 多克隆抗體（美國Abcam 公司，產(chǎn)品編號(hào)：ab121476），兔抗人Bcl-2 多克隆抗體（美國Abcam 公司，產(chǎn)品編號(hào)：ab7973）；DAB 試劑盒、EDTA 抗原修復(fù)液（博士德生物工程有限公司），本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)資料 收集中南大學(xué)湘雅醫(yī)院確診為胰腺癌患者（2013 年1 月至2016 年12 月）的腫瘤組織標(biāo)本69 例作為腫瘤組。另外收集特殊肝、腎移植手術(shù)供體的正常胰腺組織標(biāo)本11 例作為研究對(duì)照組。

1.2.2 免疫組化檢測 按說明書步驟進(jìn)行操作。PLCε1 一抗的稀釋濃度為1∶400，Bcl-2 一抗的稀釋濃度為1∶400。二抗稀釋濃度為1∶10。

收集整理患者信息、臨床病例資料。針對(duì)性選取所需組織蠟塊（胰腺癌腫瘤/正常胰腺組織），切片脫蠟切片水化、抗原修復(fù)、H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶；PLCε1 和Bcl-2 免疫組化染色，血清封閉、滴加一抗過夜孵育、二抗孵育等步驟。

1.3 結(jié)果判讀

雙盲法閱讀玻片。PLCε1、Bcl-2 陽性著色在胰腺癌細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色（PLCε1 和Bcl-2 分別圖1、圖3）。參考KOHLBERGER 的［16］免疫反應(yīng)評(píng)分（immunoreactivity score, IRS）法評(píng)分：記錄染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)得分，兩者相乘后獲得最終得分，根據(jù)得分情況分為陰性“-”、弱陽性“+”、中強(qiáng)陽性“++”、強(qiáng)陽性“+++”。0 分表示（-），1 分表示（+），2～4 分表示（++），＞4 分表示（+++）。陽性細(xì)胞數(shù)＜5%：0 分；陽性細(xì)胞數(shù)5%～30%：1 分；陽性細(xì)胞數(shù)31%～60%：2 分；陽性細(xì)胞數(shù)＞60%：3 分。陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度：淡黃色1 分，黃色2 分，棕黃色3 分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。腫瘤組與對(duì)照組中PLCε1 和Bcl-2 各自的表達(dá)差異以及不同臨床特征分組內(nèi)的分析采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法；二者各自表達(dá)強(qiáng)度在臨床及病理學(xué)特征組之間的分析使用非參數(shù)兩獨(dú)立樣本檢驗(yàn)；二者染色強(qiáng)度之間的關(guān)系使用雙因素相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 PLCε1 與Bcl-2 在腫瘤組和對(duì)照組中的表達(dá)

PLCε1 和Bcl-2 主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿內(nèi)。69例患者的腫瘤組織中有58 例PLCε1 表達(dá)陽性（見圖1），占84.1%，11 例為陰性（見圖2），占15.9%；Bcl-2 在59 例腫瘤組織中為陽性表達(dá)，占85.5% （見圖3），10 例為陰性（見圖4），占14.5%。在11 例對(duì)照組中，4 例PLCε1 表達(dá)為陽性，7 例為陰性；Bcl-2 有 3 例是陽性表達(dá)，其他8 例呈陰性。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組與對(duì)照組之間的 PLCε1 表達(dá)和 Bcl-2 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P1＜0.05,P2＜0.05）（見表1）。提示在胰腺癌組織中 PLCε1 和 Bcl-2 的表達(dá)強(qiáng)于正常胰腺組織。

2.2 腫瘤組中 PLCε1 與 Bcl-2 與臨床病理特征的關(guān)系

在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組內(nèi)，PLCε1 和 Bcl-2 各自表達(dá)明顯不同（P=0.016 和P=0.029）。對(duì)于其他分組而言差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示 PLCε1和 Bcl-2 可能與細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)移有關(guān)（見表2）。

2.3 腫瘤組中 PLCε1 和 Bcl-2 的染色強(qiáng)弱與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 （Mann-Whitney 檢驗(yàn)） 發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小組間和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間的 PLCε1 和 Bcl-2的表達(dá)強(qiáng)弱程度有差異，其余分組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （見表3）。結(jié)果提示，對(duì)于腫瘤＞5 cm 并存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，其 PLCε1 和 Bcl-2會(huì)有更多的陽性、強(qiáng)陽性表達(dá)。

表1 腫瘤組與對(duì)照組PLCε1 和Bcl-2 表達(dá)

表2 腫瘤組PLCε1 和Bcl-2 的表達(dá)情況 例

2.4 腫瘤組PLCε1 和Bcl-2 染色程度的關(guān)系

將PLCε1 和Bcl-2 在腫瘤組織中的染色得分賦值，陰性為0；弱陽性為1；陽性為2；強(qiáng)陽性為3。腫瘤組中PLCε1 與Bcl-2 的染色強(qiáng)度相關(guān)性分析顯示，二者強(qiáng)度呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r=0.639,P=0.000）。

圖1 胰腺癌組織中的PLCε1 的陽性染色圖

圖2 正常胰腺組織PLCε1 陰性染色圖（×400）

圖3 胰腺癌組織中Bcl-2 的陽性染色圖

3 討論

圖4 正常胰腺組織Bcl-2 陰性染色圖（×400）

PLCε1 是重要的信號(hào)調(diào)節(jié)分子，涉及到多種細(xì)胞機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)PKC 對(duì)胰腺癌有促進(jìn)作用［17］。PLCε1 能通過NF-κB 和VEGF-C/Bcl-2 兩條信號(hào)通路，促進(jìn)食管癌新生血管生成和細(xì)胞增殖［18］。還有microRNA 研究顯示，MiR-34a 能特異性降低PLCε1 mRNA 水平，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移［19］。Snail、PKCα/NF-κB 通路也可以受PLCε1 調(diào)控，增加腫瘤細(xì)胞分裂，促進(jìn)轉(zhuǎn)移發(fā)生［8，20］。這些研究顯示PLCε1 能夠通過下游信使發(fā)揮促瘤作用。不僅如此，PLCε1 還對(duì)ras 家族具有雙向調(diào)節(jié)作用，可以被其激活，也可以作為其下游效應(yīng)分子。眾所周知，ras 家族成員對(duì)腫瘤有重要促進(jìn)作用。隨著對(duì)ras 基因家族研究的逐步深入，研究者發(fā)現(xiàn)近30%的腫瘤內(nèi)存在ras 基因的突變，且在胰腺癌中更為突出（超過80%），并涉及到其發(fā)展的各個(gè)時(shí)期進(jìn)行研究［21-22］。Bcl-2 家族非常龐大，根據(jù)對(duì)凋亡調(diào)控的正負(fù)不同作用可將其分為兩個(gè)集團(tuán)。BAK、BAX 與單BH3 結(jié)構(gòu)域的分子合集對(duì)凋亡進(jìn)行正向調(diào)控，這其中包含了BAD、BIK、BMF 等。而Bcl-2 及其衍生分子在細(xì)胞凋亡研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)凋亡有負(fù)向調(diào)控作用。多種分子蛋白相互之間有激活或抑制的作用，使的復(fù)雜的凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中正、負(fù)效應(yīng)之間達(dá)到平衡。而某種或多種作用導(dǎo)致平衡被打破，Bcl-2 過表達(dá)，細(xì)胞凋亡抑制，是腫瘤發(fā)生的始動(dòng)因素以及促進(jìn)因素中十分重要的部分［3，6，23］。

從筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，PLCε1 在腫瘤組中的表達(dá)顯著強(qiáng)于對(duì)照組，筆者推測它可能有促進(jìn)胰腺癌的作用。這與其他學(xué)者研究中PLCε1扮演著促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的角色相符合。根據(jù)腫瘤組的結(jié)果，僅針對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，PLCε1 和Bcl-2 的染色情況存在差異，這意味著PLCε1 可能直接或間接參與某些促進(jìn)胰腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。對(duì)于腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組，PLCε1 和Bcl-2 的表達(dá)程度均存在顯著差異。這意味著如果腫瘤超過5 cm或者存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，腫瘤組織中會(huì)有更多的PLCε1 和Bcl-2。這可能是因?yàn)镻LCε1 和Bcl-2 與胰腺癌的轉(zhuǎn)移和生長相關(guān)。LAD 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，H-ras 可通過PLCE 抑制整合素產(chǎn)生，增加細(xì)胞的不穩(wěn)定性，使其易于移動(dòng)、擴(kuò)散。OU 等［10］研究中發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌中降低PLCε1 表達(dá)后，膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力會(huì)受到抑制。

除了DAG，PLCε1 產(chǎn)生的另一個(gè)信使—IP3，可調(diào)節(jié)鈣離子信號(hào)通路［25］。IP3可以對(duì)IP3R 進(jìn)行激活，并活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子通道，從而達(dá)到提高細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的效果。此時(shí)線粒體得到響應(yīng)，外膜上的鈣離子通道被激活，攝入胞質(zhì)內(nèi)過載的鈣離子，從而增加細(xì)胞質(zhì)與線粒體內(nèi)兩個(gè)部位的鈣離子濃度［26］，并活化多種與鈣離子相關(guān)的酶，如Calpain、NOS 等。這些酶活化后可以通過多種途徑促進(jìn)凋亡［27］。研究表明細(xì)胞凋亡需要IP3調(diào)節(jié)的鈣離子通路參與，而PLCε1 可以影響IP3調(diào)節(jié)，從而影響細(xì)胞凋亡。但是，這似乎與PLCε1 被發(fā)現(xiàn)的促瘤作用有些相矛盾。在胸腺瘤相關(guān)的報(bào)道中［28］表示，IP3對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上IP3R 的激活作用可以被Bcl-2 阻斷。XU［29］等在乳腺癌的研究中證明，Bcl-2 通過與IP3R 競爭性的結(jié)合，抑制鈣離子釋放，進(jìn)而抑制線粒體凋亡途徑。還有研究提示Bcl-2 能通過BH4 片段阻斷IP3R 受體［30］。對(duì)腫瘤組織中PLCε1 與Bcl-2 染色進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩個(gè)蛋白染色呈正相關(guān)。所以筆者推測，Bcl-2 在胰腺癌組織中高表達(dá)，然后通過多種機(jī)制，干擾PLCε1 對(duì)鈣離子通路的調(diào)節(jié)，兩者協(xié)同地促進(jìn)腫瘤生長。

綜上，對(duì)于胰腺癌患者，其胰腺組織中PLCε1和Bcl-2 的表達(dá)高于正常胰腺組織，兩者可能與胰腺癌的生長、轉(zhuǎn)移有關(guān)。而PLCε1 和Bcl-2 在胰腺癌表達(dá)中密切相關(guān)，提示兩者可能共同參與胰腺癌內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。