支氣管哮喘患兒血清25(OH)D3水平與血清及支氣管肺泡灌洗液中microRNA-126的關系

李長青

（新鄭市人民醫院新生兒科，河南新鄭451100）

支氣管哮喘是最常見的慢性呼吸道疾病之一，發病率每年都在上升。一些研究表明，維生素D的差異與哮喘兒童的狀態存在一定的聯系，維生素D 對哮喘的免疫調節功能具有全面的預防作用，但具體機制還不太明確［1］。microRNA-126（miR-126） 是一種內皮細胞特異性微小核糖核酸（microRNA,miRNA），在呼吸系統、造血系統、消化系統及心血管再生中表達［2］。在用卵清蛋白致敏的慢性哮喘模型中，miR-126 在氣道中高表達；相反，通過長期施用拮抗劑抑制miR-126 的表達，可以抑制嗜酸性粒細胞募集到氣道中［3］。本研究擬檢測支氣管哮喘患兒血清25-羥維生素D3［25-OH-VitD3，25(OH)D3］水平與血清及支氣管肺泡灌洗液中microRNA-126 水平，分析25(OH)D3、microRNA-126 在支氣管哮喘中作用和機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017 年1 月至2019 年1 月在該院接受治療的51 例支氣管哮喘患兒（哮喘組）作為研究對象，其中男36 例，女15 例；年齡1～9（6.7±1.1）歲。所有患兒均符合支氣管哮喘診斷標準，排除伴有嚴重心肝腎疾病的患兒，排除1 個月內使用過糖皮質激素以及近3 個月服用維生素D 的患兒。所有患兒依據血清25(OH)D3水平分為3 組，維生素D 適當組（＞30 ng/ml,n=7）、不足組（20～30 ng/ml,n=14）和缺乏組（＜20 ng/ml,n=30）。同期選擇15 例因支氣管異物接受治療的患兒為對照組，其中男11 例，女4 例；年齡1～9（6.5±1.2）歲。哮喘組和對照組患兒的性別、年齡等一般資料差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。研究前，患兒家屬均簽署知情同意書，并經院倫理委員會批準。

1.2 標本采集

①所有哮喘患兒采取左肺舌葉病變采集支氣管肺泡灌洗液 （bronchoalveolar lavage fluid,BALF），對照組選擇非異物側肺進行灌洗。BALF離心后，上清液置于-70℃保存。②所有患兒入院后均采集空腹血4 ml，3 000 rpm 5 min，取血清置于-70℃保存。酶聯免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法檢測各組患兒血清25(OH)D3水平。

1.3 血清及BALF 中miR-126 水平測定

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）確定miR-126 相對水平。TRIzol 試劑提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒合成cDNA。采用CFX-96 PCR 擴增儀（美國Bio-rad 公司），U6 作為內部參考基因。引物序列由上海英駿公司提供。miR-126 上游序列：5'-GCTGGCGACGGGACATTATTA-3'，下游序列：5'-CCGTGGACGGCGCATTATTA-3'，產物82 bp。反應體系總共為20 μl：10 μl SYBR 預混物Ex Taq?（2x），2 μl PCR 上游引物（5 μmol/L），2 μl PCR 下游引物（5 μmol/L），2 μl 逆轉錄產物和4 μl 無RNA 聚合酶的水。反應進行45 個循環，變性發生在95℃30 s，然后退火55°C 30 s，72°C 延伸30 s。采用相對定量2-△△Ct法比較目的基因水平。

1.4 肺功能檢測

采用英國比特勒肺功能檢測儀檢測最大呼氣流量（peak expiratory flow,PEF）、第1 秒用力呼氣容積 （forced expiratory volume in one second,FEV1），并計算第1 秒用力呼氣容積占預計值的百分比（FEV1%）和FEV1/用力肺活量（forced vital capacity,FVC）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件，計量資料以均數±標準差（±s） 表示，多組間比較采用one-way ANOVA 分析，組間比較采用t檢驗。計數資料以百分比（%）表示，采用χ2檢驗。采用Pearson 進行相關分析，P＜0.05 為差異有統計學意義

2 結果

2.1 血清miR-126、25(OH)D3 水平以及BALF中miR-126 比較

哮喘組血清25(OH)D3明顯低于對照組、血清miR-126、BALF miR-126 明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 不同血清25(OH)D3水平患兒血清miR-126、BALF miR-126 水平比較

各組患兒的血清25(OH)D3、miR-126 以及BALF miR-126 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中缺乏組、不足組、適當組血清miR-126、BALF miR-126 水平明顯高于對照組（P＜0.05），缺乏組、不足組miR-126、BALF miR-126 水平明顯高于適當組（P＜0.05），而缺乏組明顯高于不足組（P＜0.05）。見表2。

2.3 不同血清25(OH)D3水平患兒肺功能比較

各組患兒的PEF、FEV1% 以及FEV1/FVC 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中缺乏組、不足組、適當組PEF、FEV1% 以及FEV1/FVC 水平明顯低于于對照組（P＜0.05），缺乏組、不足組PEF、FEV1%以及FEV1/FVC 水平明顯低于適當組（P＜0.05），而不足組明顯低于適當組（P＜0.05）。見表3。

2.4 相關性分析

血清25(OH)D3水平與BALF 中miR-126 呈負相關（r=-0.521,P＜0.05），與PEF、FEV1%、FEV1/FVC 呈正相關（分別r=0.478、0.432、0.501,P＜0.05）。

表1 血清miR-126 和25(OH)D3水平比較 （±s）

表1 血清miR-126 和25(OH)D3水平比較 （±s）

BALF miR-126 3.47±0.49 7.22±2.59 5.549 0.000組別對照組哮喘組t值P值例數15 51血清25(OH)D3/(ng/ml)38.54±6.43 19.21±5.96 10.849 0.000血清miR-126 3.46±0.52 6.24±1.46 7.207 0.000

表2 不同血清25(OH)D3水平患兒血清miR-126、BALF miR-126 水平比較 （±s）

表2 不同血清25(OH)D3水平患兒血清miR-126、BALF miR-126 水平比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與適當組比較，P ＜0.05；3）與不足組比較，P ＜0.05。

BALF miR-126 3.47±0.49 5.16±1.141)6.06±1.251)2)8.98±1.481)2)3)31.476 0.000組別對照組適當組不足組缺乏組F值P值例數15 7 14 30血清25(OH)D3/(ng/ml)38.54±6.43 32.81±0.841)24.54±2.741)2)15.63±1.761)2)3)155.600 0.000血清miR-126 3.46±0.52 4.78±1.081)5.29±1.231)2)7.25±1.331)2)3)39.340 0.000

表3 不同血清25(OH)D3水平肺功能比較 （±s）

表3 不同血清25(OH)D3水平肺功能比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與適當組比較，P ＜0.05；3）與不足組比較，P ＜0.05。

FEV1/FVC 87.22±1.82 79.26±1.351)73.58±1.521)2)70.18±1.221)2)3)2 487.331 0.000組別對照組適當組不足組缺乏組F值P值例數15 7 14 30 PEF/(L/min)89.27±1.07 71.28±1.421)64.38±1.091)2)50.33±1.581)2)3)2 771.000 0.000 FEV1%/%84.25±1.11 79.28±1.361)76.24±1.471)2)69.46±1.571)2)3)2 548.358 0.000

3 討論

哮喘的特征是慢性氣道炎癥、氣道高反應性和不可逆的氣道重塑，但其發病機制尚不清楚［4］。目前的哮喘治療主要依靠長期吸入糖皮質激素［5］。雖然糖皮質激素能緩解支氣管哮喘，但他們無法控制涉及荷爾蒙的難治性哮喘抵抗和激素依賴性。此外，糖皮質激素易引起副作用，如生長和發育抑制、肥胖［6］。因此，迫切需要進一步了解哮喘的發病機制，并找出治療氣道炎癥的新方法。目前的研究顯示，合適的循環維生素D 水平對患兒具有保護作用，能有效地減少哮喘［7］。一些流行病學研究表明，妊娠期母親維生素D 攝入量低與后代喘息表型風險增加有關［8］。本研究中，哮喘組患兒的血清25(OH)D3水平明顯低于對照組，這說明哮喘患兒普遍存在維生素D 不足或缺乏。而且通過相關性分析也顯示，25(OH)D3水平與PEF、FEV1%、FEV1/FVC 呈正相關，提示25(OH)D3參與了哮喘的發生和進展。

微小RNA（miRNA）為一類小的非編碼RNA分子，能夠識別特定的靶信使RNA（mRNA）并在轉錄后調節靶基因的表達水平，作為免疫反應的調節者［9］。 microRNA-126 定位于染色體9q34.3，在肺和心臟組織中高表達，尤其在內皮細胞上能鑒定出microRNA-126 的高表達水平，其可通過抑制血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）途徑調節血管生成和血管完整性［10］。一些研究指出，miR-126 在過敏性呼吸系統疾病中異常表達，尤其哮喘患者支氣管上皮細胞中miR-126 的表達水平明顯上調，并與白細胞介素（interleukin,IL）-13 呈現相關性，可以促進細胞因子IL-13 水平的升高，這表明miR-126可以作為一個相關因素進行研究［11］。而且改變miR-126 已被證明可以改善治療后的效果，這也表明miRNA 的變化對哮喘癥狀持續存在至關重要［12］。本研究中，哮喘組患兒的miR-126 相對水平明顯高于對照組，表明miR-126 可能參與了哮喘的發生和進展。直線相關分析顯示，血清25(OH)D3與BALF 中miR-126 呈負相關，說明25(OH)D3與BALF 中miR-126 共同參與了哮喘的發生和進展。其原因可能是低水平的血清25(OH)D3可能導致系統性炎癥的加劇、外周血和BALF 中miR-126 的相對水平增加、免疫系統的失衡。結果炎癥細胞釋放更多炎癥因子，加重疾病嚴重程度，這也提示miR-126 可能在促進免疫失衡中發揮作用。

總之，低水平25(OH)D3可能促使miR-126 表達在哮喘患兒的外周血及BALF 中上調，并導致免疫失衡，肺功能水平下調，并與疾病嚴重程度存在一定的聯系，因此，miR-126 可用作哮喘輔助診斷和評估潛在血清學標志物。