原發性肝癌組織中STMN1及Cav-1蛋白的表達及其在預后評估中的意義

黃建 包大偉 劉文杰 周武碧 吳涵 李秀芳 張千 張正衛

原發性肝癌是最常見的原發性肝臟惡性腫瘤[1]，每年約有75萬新病例確診，近50萬患者死于肝癌[2]。因此，識別與腫瘤侵襲、轉移相關的生物學標記物，可為肝癌的診治及改善預后提供新靶點。微管去穩定化磷蛋白1(Stathmin-1，STMN1)是一種近年來研究廣泛的微管蛋白，可參與信號通路的調節。有研究發現，STMN1在多種腫瘤組織中表達上調，與癌癥的腫瘤惡性程度、侵襲和遷移有關[3]。小窩蛋白-1(Caveolin-1, Cav-1)是一種具有參與信號轉導等細胞活動功能的支架蛋白[4]。經研究證實，Cav-1的表達水平與癌癥轉移呈正相關[5]。本研究旨在探討STMN1和Cav-1在原發性肝癌組織中的表達水平，并進一步評估其臨床病理和預后價值。

資料與方法

一、一般資料

收集我院2015年1月至2017年9月手術切除的新鮮肝癌組織與癌旁組織標本107例。收集患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移、腫瘤分期、TNM分期等臨床病理參數。所有組織標本立即采集，液氮冷凍保存，以備進一步研究。取部分組織用10%多聚甲醛固定、石蠟包埋。參與本臨床試驗和研究前，均已取得患者書面知情同意，研究方案經我院倫理委員會批準。排除標準：1)臨床病理資料不完整；2)存在其他系統組織器官惡性腫瘤；3)接受過術前治療，如化療、放療或其他相關抗腫瘤治療。患者臨床病理特征見表1。對術后患者以電話、上門、門診或住院的方式進行定期隨訪，記錄患者預后情況(包括復發、轉移及死亡情況)。

二、研究方法

(一)免疫組化SP法 采用免疫組織化學SP染色法檢測肝癌和癌旁組織中TMN1和caveolin-1的表達水平。操作如下：(1) 石蠟包埋標本切片(4 μm)表面覆蓋APES(Sigma，美國)；(2) 染色前切片經水沖洗，室溫48 h晾干；(3) 二甲苯切片脫蠟，經梯度乙醇水化；(4) 3%過氧化氫溶液室溫處理15 min，阻斷內源性過氧化物酶活性；(5) 95 ℃，0.1 mol/L檸檬酸緩沖浸泡20 min，后用PBS沖洗；(6) 分別用兔抗人多克隆抗體STMN1(1∶50，Cell Signaling，美國)和兔抗人多克隆抗體Cav-1(1∶50，Santa Cruz Biotechnology，美國)4℃孵育過夜；(7) 用生物素標記的山羊抗兔IgG(1∶2 000，Zsbio，中國)室溫孵育20 min；(8) 用過氧化酶標記的鏈霉菌素室溫孵育20 min；(9)切片用DAB顯色，蘇木精復染；(10) 切片沖洗、干燥、中性膠封片，顯微鏡下觀察。已知陽性反應片為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。

(二)結果判斷 STMN1以細胞質出現淺黃色、棕黃色或棕色顆粒為陽性表達，Cav-1以細胞膜或胞質出現黃褐色或褐色顆粒為陽性表達。每張切片隨機選取5個高倍視野，根據染色強度確定表達水平：與陰性對照相同為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；根據觀察細胞中陽性細胞的比例評分：著色細胞比例<5%為0分，5～25%為1分，>25%～50%為2分，>50～75%為3分，>75%為4分。最后通過染色強度分數乘以陽性細胞百分比計算最終得分，≥3分為陽性，<3分為陰性。

三、統計學處理

結 果

一、肝癌組織和癌旁組織STMN1和Cav-1表達

肝癌組織STMN1蛋白陽性比68.22%、Cav-1蛋白陽性表達率為69.16%，顯著高于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

表1 STMN1、Cav-1與臨床特征的關系比[例(%)]

續表1

注：a表示與未發生分化比較，P<0.05，b表示與無轉移比較，P<0.05，c表示與TNM0期比較，P<0.05，d表示與未累及肝被膜比較，P<0.05

二、STMN1、Cav-1的表達與肝癌臨床病理特征的關系

STMN1蛋白表達水平與患者肝癌腫瘤中分化、發生轉移及TNM的I-II期顯著相關(P<0.05)，但與其他變量如性別、年齡、HBsAg陽性表達等無明顯相關性(P>0.05)。Cav-1蛋白表達水平與患者肝癌腫瘤中低分化程度、發生轉移及癌組織累及肝被膜顯著相關(P<0.05)，但與其他變量無明顯相關性(P>0.05)，見表1。

三、STMN1與患者預后狀況相關性分析

STMN1蛋白在陽性患者生存時間中位數為28.30個月，陰性患者平均生存時間為34.50個月，差異具有統計學意義(P<0.05)。

五、Cav-1與患者預后狀況相關性分析

Cav-1蛋白在陽性患者中位生存時間為33.10個月，陰性患者平均生存時間為39.10個月，差異具有統計學意義(P<0.05)。

討 論

STMN1是一種不穩定微管調節蛋白，在多種癌癥中高表達[6, 7]。Tan等在原發性結直腸腫瘤細胞中檢測到STMN1水平上調，且與腫瘤細胞的遷移、侵襲、黏附活動呈正相關[8]。本研究證實，STMN1蛋白在肝癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織，且與肝癌組織的分化程度、轉移及進展情況有關，這與Tan等的研究結果一致。本研究還證實，可通過檢測肝癌患者癌組織中的STMN-1表達水平預測肝癌的轉移及預后情況。

有研究發現Cav-1在一些腫瘤組織中的表達水平明顯高于正常組織。Tse等在肝癌及相關細胞系中發現Cav-1蛋白表達水平上調[9]。此外，Cav-1的高表達與腫瘤靜脈浸潤及轉移有關，提示我們Cav-1蛋白的高表達水平可能促進了腫瘤的發生、進展、浸潤和轉移。本研究通過檢測肝癌組織中Cav-1表達，與多種病理學特征進行相關性分析發現，Cav-1與肝癌的分化、侵襲和轉移有關。另外，術后隨訪證實患者的生存時間與Cav-1蛋白的表達情況顯著相關，這與Tse等的研究結果類似。提示STMN1和Cav-1對肝癌的治療和預后預測有一定指導意義。