外周血γδT細胞在評估Peg-IFN α-2a治療慢性乙型肝炎效果中的應用價值

支星 顏學兵

近年來，聚乙二醇干擾素(Peg-IFN)α-2a在慢性乙型肝炎(CHB)治療中被應用，與常規α-干擾素相比，Peg-IFN α-2a的耐藥率更低，療效更可靠[1-2]。γδT細胞是比較特殊的一類T淋巴細胞，其組成部分包括γ鏈與δ鏈，既往有研究發現，γδT細胞在外周血中的異常表達參與了肝炎進展過程，如對慢性丙型肝炎患者而言，其外周血γδT細胞持續異常與肝臟炎癥程度密切相關[3]。本研究分析外周血γδT細胞在評估Peg-IFNα-2a治療CHB效果中的應用價值，旨在進一步了解Peg-IFN α-2a的臨床療效及外周血γδT細胞對CHB療效的影響。

資料與方法

一、一般資料

回顧性分析我院2016年4月—2018年4月收治的106例CHB患者的臨床資料，其中男59例，女47例，年齡32～74歲，平均(52.53±12.16)歲；病程1～5年，平均(3.41±1.37)年；肝纖維化程度：S1期15例、S2期41例、S3期38例、S4期12例；炎癥程度：G1級14例、G2級45例、G3級35例、G4級12例。

二、納入與排除標準

(一)納入標準 (1)參考相關診斷標準確診為CHB[4]，診斷明確；(2)入院前6個月內無抗病毒治療史；(3)病例資料完整；(4)入院后接受Peg-IFNα-2a治療；(5)遵循醫囑定期入院復查。

(二)排除標準 (1)合并血液性疾病；(2)糖尿病患者；(3)既往有精神病史、神經病史；(4)妊娠、哺乳期婦女；(5)腎、心、腦等器官損害；(6)其他類型的肝病，如甲型肝炎、丙型肝炎等。

三、方法

(一)治療方法 所有患者均給予Peg-IFNα-2a(派羅欣，羅氏制藥，國藥準字J20120075)治療，每次180 μg派羅欣皮下注射，每周1次，治療12個月。在治療期間，患者每隔3個月入院復查一次，必要情況下進行降酶藥物干預，期間不采用其他藥物治療。

(二)檢測方法

1.乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)檢測：選取3 mL空腹靜脈血，經高壓滅菌后置于EP管內，利用實時熒光定量PCR法測定血清HBV DNA水平，試劑盒源于生工生物，嚴格根據試劑盒完成操作。反應條件：37 ℃ 120 s，94 ℃ 120 s，(93 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，循環40次)。

2.外周血γδT細胞檢測：主要儀器為酶標儀(生工生物)、培養箱(上海森信)、流式細胞儀(貝克曼)，主要試劑為小牛血清(江蘇寶萊)、酶聯免疫試劑盒(生工生物)、rhIL-2(江蘇寶萊)、RPMI1640(江蘇寶萊)。采集4 mL空腹靜脈血抗凝，將單個核細胞分離出來，經磷酸鹽緩沖液進行洗滌，對白細胞予以收集，使其濃度為1 106個/mL，接入24孔板進行培養，分別加入IPP、rhIL-2，其中rhIL-2每隔2 d補加一次。按照細胞具體的增殖狀態分孔培養。經Hanks液體進行3次沖洗，使細胞濃度調整為5 106個/mL，取細胞懸液100 μL加入流式管，取0.5 μg抗人TCR-γδ-FITC加入，充分混合，在4 ℃條件下反應30 min，離心、洗滌，經流式細胞儀測定。

四、觀察指標

根據患者治療12個月后的臨床療效分為病毒學應答組、病毒學無應答組，比較病毒學應答組、病毒學無應答組的外周血γδT細胞、HBV DNA水平。病毒學應答[4]：采取熒光PCR法檢測HBV DNA，<300拷貝/mL則為病毒學應答，其他為無應答。

五、統計學方法

結 果

一、106例患者的治療效果分析

在106例CHB患者中，病毒學應答85例(80.19%)，病毒學無應答21例(19.81%)。

二、兩組外周血γδT細胞、HBV DNA水平比較

治療前，病毒學應答組、病毒學無應答組的外周血γδT細胞分別為(5.62±0.98)%、(5.60±0.95)%，治療后分別為(2.39±0.62)%、(5.58±0.91)%。治療前，病毒學應答組、病毒學無應答組的HBV DNA分別為(6.43±1.02)lg拷貝/mL、(6.45±1.04)lg拷貝/mL，治療后分別為(3.32±0.73)lg拷貝/mL、(6.41±0.99)lg拷貝/mL。兩組治療前外周血γδT細胞、HBV DNA比較差異無統計學意義(P>0.05)，病毒學應答組治療后外周血γδT細胞、HBV DNA低于治療前及病毒學無應答組(P<0.05)。

三、外周血γδT細胞對CHB療效的評估價值分析

外周血γδT細胞評估CHB療效的曲線下面積為0.653(標準誤=0.061，P=0.012，95%CI=0.534～0.772)，最佳截斷值為4.11%，敏感度為60.06%，特異度為58.90%。ROC曲線見表1。

圖1 外周血γδT細胞評估CHB療效的ROC曲線

討 論

約1%～5%CHB患者發展成原發性肝癌[5]。為了改善患者預后，本研究針對CHB患者采用Peg-IFNα-2a治療，結果提示在106例患者中，總病毒學應答率為80.19%，與相關研究結論基本吻合[6]。Peg-IFNα-2a將普通干擾素、聚乙二醇相結合，可促使干擾素藥物特性出現變化，延長半衰期，提高血藥濃度的穩定性，能更持久地抑制HBV DNA，每周給藥1次即可，且治療安全性高。研究表明Peg-IFN α-2a的病毒抑制效果優于普通干擾素，且不會增加不良反應[7]。這進一步證實該藥在CHB中適用。

本研究提示，病毒學應答組治療后的外周血γδT細胞、HBV DNA水平較治療前明顯降低，且低于病毒學無應答組，提示二者在血液中的表達水平與患者的臨床療效密切相關。有研究者以慢性丙型肝炎患者為研究對象，發現γδT細胞在這類患者外周血中呈高表達，抗病毒干預時間越長，患者的外周血γδT細胞水平越低[8]。本研究通過繪制ROC曲線，證實外周血γδT細胞對CHB患者的抗病毒療效也具有評估價值，創新之處在于明確了曲線下面積、最佳截斷值以及相應的敏感度、特異度，提示以外周血γδT細胞>4.110%時，患者經Peg-IFN α-2a治療病毒學無應答的風險越高。

本研究發現CHB患者的外周血γδT細胞與HBV DNA呈正相關，表明隨著外周血γδT細胞水平越高，患者HBV DNA也相應增加，提示病情越重。在經Peg-IFN α-2a治療后，患者的外周血γδT細胞水平下調，HBV DNA也相應下調，提示病情緩解。基于此，臨床醫師可將外周血γδT細胞、HBV DNA共同作為評估CHB患者病情的重要指標，便于進一步評估臨床療效，改善預后。