延齡草總皂苷提取純化工藝及其抗腫瘤活性*

姚敏娜，劉利兵，李曉明，白宏

(西安培華學院醫學院，西安 710125)

延齡草為百合科植物延齡草(TrilliumtschonoskiiMaxim.) 的干燥根及根莖，為傳統名貴中藥，也是恩施土家族四大名藥之一，具有鎮靜、止痛、活血、止血等功效，主要用于治療高血壓、神經衰弱、眩暈頭痛、腰腿疼痛、月經不調、崩漏、外傷出血、跌打損傷等[1]。延齡草化學成分主要有甾體皂苷、倍半萜苷、黃酮、苯丙素、多糖等，尤以甾體皂苷為主[2]，現代藥理學研究表明，該類成分具有抗腫瘤、抗炎、保肝等作用[3-9]。目前，對延齡草皂苷的化學成分和藥理活性的研究較多，而有關其提取和純化工藝鮮有報道，因此，筆者在本實驗對延齡草總皂苷的提取和純化工藝進行系統研究，以期得到純度較高的有效成分，并考察總皂苷體內外抗腫瘤活性，為延齡草藥用資源的合理開發、利用奠定理論基礎。

1 儀器與試藥

1.1儀器 BS110S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司，感量：0.01 mg)；KQ5200DE型數控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；N-1001 旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)； UV1101 紫外/可見分光光度儀(上海天美科學儀器有限公司)；ZMT-413倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；SpectraMax M5 酶標儀[熱電(上海)科技儀器有限公司]。

1.2試藥 延齡草采自湖北省神農架林區，經陜西師范大學康杰芳副教授鑒定為百合科延齡草屬植物延齡草(TrilliumtschonoskiiMaxin.)的干燥根及根莖；薯蕷皂苷元對照品 (中國食品藥品檢定研究院，批號：1539-200001)；AB-8(西安藍曉科技有限公司)、HPD100、HPD400(滄州寶恩化工有限公司)，D101、NAK-9 (天津南開大學化工廠)。RPMI-1640 培養基(美國 HyClone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；噻唑藍 (MTT，Sigma 公司)；環磷酰胺 (CTX) 注射液(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：15020321)。人宮頸癌Hela細胞株、人肺癌A549細胞株、人乳腺癌MCF-7細胞株、S180 細胞均購自于中國科學院上海細胞生物研究所。

1.3實驗動物 清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量(20±2) g由第四軍醫大學動物實驗中心提供。實驗動物生產許可證號：SCXK (軍)字第2012-007號。

2 方法與結果

2.1延齡草總皂苷含量測定

2.1.1對照品溶液的制備 精密稱取薯蕷皂苷元對照品5.0 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得。

2.1.2供試品溶液的制備 取乙醇濃縮液，用水100 mL轉移出殘留物，用同體積水飽和正丁醇萃取4次，正丁醇層水浴蒸干，用甲醇溶解并定量至25 mL量瓶中，精密吸取2.5 mL轉移至50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。取大孔樹脂柱洗脫液適量直接用作其總皂苷含量測定的供試品溶液。

2.1.3檢測 波長的確定參照文獻[9]方法。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液0.2 mL，置于10 mL具塞試管中，揮干溶劑，精密加入高氯酸5 mL，密塞搖勻，置25 ℃恒溫水浴鍋中保溫25 min，取出冷卻至室溫。以高氯酸為空白對照，在紫外-可見分光光度計上于350～800 nm波長范圍內掃描，測定紫外可見吸收光譜。結果對照品與樣品溶液的最大吸收波長均為410 nm，故選擇 410 nm為測定波長。

2.1.4線性關系考察 精密吸取對照品溶液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置于10 mL具塞試管中，按“2.1.3”項下方法測定吸光度(A值)。以A值為縱坐標，相應溶液中薯蕷皂苷元含量(C)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程A=0.184 4C+0.001 4，r=0.999 5。結果表明，薯蕷皂苷元在0.01～ 0.1 mg呈良好的線性關系。

2.1.5總皂苷的測定 精密吸取供試品溶液0.2 mL，按照“2.1.4”項下方法測定吸光度值，通過標準曲線計算得到樣品總皂苷的含量。

2.2提取工藝研究

2.2.1提取溶劑確定 取延齡草粉末5.0 g，精密稱定，分別加入水和30%，50%，70%，90%乙醇，甲醇超聲提取，超聲時間40 min，溫度60℃，料液比(g·mL-1)1：50，濾過，濾液經濃縮回收溶劑后，得乙醇濃縮液按“2.1.2”項下制備供試品溶液，按“2.1.3”項下方法測定總皂苷提取率，結果分別為0.45%，0.78%，1.55%，2.04%，1.83%，2.10%。結果表明甲醇提取率最高，其次是不同濃度的乙醇，水次之，但因甲醇毒性較乙醇大，考慮到安全性、可操作性，且乙醇更適合于工業化生產，因此本實驗選擇乙醇為提取溶劑。

2.2.2正交實驗 經相關文獻調研和多次預實驗，選擇乙醇體積分數、超聲時間、料液比、提取溫度為考察因素，以延齡草總皂苷提取率及出膏率的綜合評分為考察指標，在權重系數上，考慮到總皂苷是延齡草的主要有效部位，浸膏得率也是常用的評價指標，根據實際情況并參照常用比例，將總皂苷提取率和出膏率權重系數分別設為0.7和0.3[10]。稱取延齡草粉末9 份，每份5.0 g，按L9(34) 正交表進行實驗設計，因素水平見表1，正交實驗結果及方差分析見表2，3。

表1 各因素水平表

由直觀分析可知，各因素對延齡草總皂苷提取工藝的影響順序A>C>D>B，即乙醇濃度>料液比>提取溫度>超聲時間，方差分析表明乙醇濃度和料液比對總皂苷提取率的影響有顯著性差異(P<0.05)，其他因素則無顯著影響。確定最佳工藝A3B2C3D3，即乙醇濃度80%，超聲時間40 min，料液比1：50，提取溫度60 ℃。

2.2.3驗證實驗 按優選的最佳工藝提取3批樣品進行驗證實驗，依法測得延齡草總皂苷的提取率分別為2.10%，2.14%，2.12%，平均提取率為2.12%(RSD=0.94%)，出膏率平均為27.72%，表明最佳提取工藝合理、穩定、可行。

表2 正交分析實驗結果

綜合評分：c= 30×a/amax+70×b/bmax。

Comprehensive scores: c= 30×a/amax+70×b/bmax.

表3 方差分析表

F0.05(2，2)=19.00。

F0.05(2，2)=19.00.

2.3純化工藝研究

2.3.1樣品溶液的制備 取延齡草粉末200 g，按優化工藝提取，合并提取液，減壓回收乙醇，溶液稀釋至含生藥0.2 g·mL-1，總皂苷濃度4.28 mg·mL-1，過濾，作為純化工藝的樣品溶液。

2.3.2樹脂預處理 取適量大孔樹脂，加95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹后濕法裝柱，用95%乙醇洗脫至流出液加水混合(體積比1：2) 不產生白色渾濁為止，加水洗至無醇味，用5%氫氧化鈉溶液5 BV洗脫，加水洗至中性，用5%鹽酸溶液5 BV洗脫，水洗至中性，備用。

2.3.3樹脂的篩選 參照文獻[11]方法。取預處理好的各樹脂1.0 g，置于 100 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入含總皂苷 4.28 mg·mL-1的延齡草溶液20 mL，密塞瓶口，置于搖床中，在室溫下以120 r·min-1振搖24 h，充分吸附后，測定溶液中總皂苷的量，計算各樹脂的靜態吸附量。抽濾分開樹脂和吸附后的溶液，樹脂用蒸餾水洗滌至不滴水為止，置100 mL具塞錐形瓶中，加入95%乙醇20 mL，密塞，同上述條件震蕩24 h，充分解吸后，測定解吸液中總皂苷的量，計算各種樹脂的解吸率。結果見表 4。從表4可以看出，D101型大孔樹脂具有較高的比吸附量和解吸率，因此選用D101型大孔樹脂比較合適。

表4 不同型號大孔樹脂的靜態吸附結果

Tab.4Resultsofstaticadsorptiontestondifferenttypesofmacroporousresins

樹脂型號吸附量/(mg·g-1)解吸率/%AB-868.5682.92HPD-10070.1586.59D10175.0189.46HPD-40045.3680.16NAK-938.2979.90

2.3.4泄露曲線的繪制 取已經處理好的D101樹脂5 g，濕法裝柱，取4.28 mg·mL-1延齡草皂苷提取液緩慢上樣，以2 BV·h-1流速接取流出液，每10mL 接1 份，共收集12 管，測定總皂苷含量[12]。結果上樣至第9份時流出液中總皂苷含量顯著增大，出現明顯泄露，故確定最大上樣量為80 mL (4BV)。見圖1。

圖1 延齡草總皂苷泄露曲線

Fig.1LeakagecurveoftotalsaponinsfromTrilliumtschonoskiiMaxim

2.3.5洗脫劑體積分數的考察 取預處理好的D101大孔樹脂5 g，濕法裝柱，取6 份總皂苷質量分數為4.28 mg·mL-1的樣品溶液，每份80 mL，以2 BV·h-1體積流量上樣，先用3 BV水脫至流出液無色后，再分別用35%，55%，75%，95%乙醇洗脫至無明顯顏色，收集洗脫液，測定不同體積分數的乙醇洗脫得到的解吸液的解吸率。結果解吸率分別為26.52%，55.54%，90.01%，90.45%，隨著乙醇濃度的升高，解吸率也在提高，但95% 較75%提高不明顯。因此，確定75%乙醇為洗脫劑。

2.3.6洗脫劑用量的考察 取預處理好的D101大孔樹脂5 g，濕法裝柱，準確吸取上樣液80 mL，以2 BV·h-1體積流量上樣，先用3 BV水洗至流出液無色，再用75%乙醇以2 BV·h-1的體積流量洗脫8 BV，每 1 BV 收集 1份，測定總皂苷含量，結果見表5。由表5可以看出，第5份以后洗脫液中總皂苷質量濃度已經很低，可認為4 BV時已經把總皂苷基本洗脫完全，從生產成本及洗脫效率方面綜合考慮，選定 4 BV 為最佳的洗脫劑用量。

表5 洗脫劑用量的考察

Tab.5Investigationontheeluentamount

流份總皂苷含量/mg142.182103.783112.16453.98流份總皂苷含量/mg59.5267.3275.7683.03

2.3.7純化工藝驗證 根據以上各單因素最佳條件，平行3份，進行驗證性實驗，經計算，回流提取物中總皂苷純度分別為7.57%，7.72%，7.64%，而純化后延齡草總皂苷含量分別為60.23%，62.68%，61.45%，平均含量為61.45%，平均洗脫率為92.08%。

2.4延齡草總皂苷的體外抗腫瘤活性

2.4.1方法 取處于對數生長期的細胞以每孔5×103個，接種于 96 孔板內，置于37 ℃、5% 二氧化碳(CO2)細胞孵箱中培養24 h。待細胞充分貼壁后，分別加入含不同濃度延齡草總皂苷 (1，5，10，20，40，80，160 μg·mL-1)的RPMI-1640培養液 100 μL，對照組加入含1‰ DMSO培養液100 μL，每組設3個平行孔。將 96 孔板置于培養箱繼續培養 24 h。取出培養板，每孔加入5 g·L-1MTT溶液 20 μL，再繼續培養4 h。棄去上清液，每孔加入DMSO150 μL，于微量振蕩儀上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。酶標儀上檢測各孔490 nm 波長A值，按下面公式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率=(1-給藥組A值/對照組A值) ×100%，并采用SPSS 17.0版統計軟件計算得出IC50值。實驗重復3次。

2.4.2結果 延齡草總皂苷在體外對MCF-7、Hela、A549 3種腫瘤細胞株均具有一定的抑制作用，IC50依次為(7.89±1.13)，(8.18±1.04)，(28.5±3.16) μg·mL-1，其中對MCF-7及Hela 細胞的抑制作用較為顯著。

2.5延齡草總皂苷對小鼠移植S180 肉瘤的抑制作用

2.5.1方法 將在無菌條件下抽取接種 7 d的 S180 肉瘤小鼠腹腔積液，用0.9%氯化鈉溶液調節細胞濃度為1×107個·mL-1，接種于小鼠右腋皮下，接種 24 h 后，將50 只小鼠隨機平均分為5組，即模型組、環磷酰胺組 (20 mg·kg-1)、延齡草總皂苷小劑量組 (25 mg·kg-1)、中劑量組 (50 mg·kg-1)、大劑量組 (100 mg·kg-1)。除了環磷酰胺組需間隔1 d進行腹腔注射給藥外，其他均灌胃給藥 10 d，末次給藥 24 h 后，處死動物，剪開腫瘤部位，剝離瘤塊，用濾紙吸凈其上液體，稱瘤塊質量，計算抑瘤率。同時分離胸腺、脾臟，精密稱重，計算脾臟指數、胸腺指數。公式為抑瘤率(%)=(模型組瘤質量-給藥組瘤質量) /模型組瘤質量×100%；臟器指數(mg·g-1)=臟器質量(mg)/體質量(g)。

2.5.2結果 延齡草總皂苷對小鼠移植S180 肉瘤的抑制作用見表6。

與模型組比較，環磷酰胺組瘤質量顯著降低(P<0.01)，但對小鼠胸腺、脾臟指數具有較強的抑制作用(P<0.01)。與模型組比較，延齡草總皂苷3個劑量組對S180荷瘤小鼠腫瘤生長均有不同程度的下降，抑瘤率分別為12.6%，32.9%，58.0%，其中大劑量組抑瘤率與環磷酰胺組相當，表現出對小鼠移植S180 肉瘤較好的抑制作用。與模型組比較，延齡草總皂苷3個劑量組小鼠胸腺、脾臟指數均無明顯改變。

表6 延齡草總皂苷對S180荷瘤小鼠腫瘤生長、脾臟指數和胸腺指數的影響

與模型組比較，t=3.280，*1P<0.05，t=3.876 ～8.048，*2P<0.01。

Compared with model group，t=3.280，*1P<0.05，t=3.876-8.048，*2P<0.01.

3 討論

與化學治療(化療)比較，天然植物作為抗腫瘤藥物，具有毒副作用小、降低腫瘤細胞耐藥性、提高患者生活質量等優點，因此被廣泛關注[13]。新藥研發難度越來越大，探索現有的已被廣泛用于臨床治療其他疾病的藥物的新用途已成為新藥開發中最快捷、最有效的策略之一[14]。延齡草作為國家名貴中藥，在中國民間尤其是土家族和苗族廣泛應用，《中華本草》和《土家族醫藥學概論》記載，在臨床上常用于治療頭暈目眩、頭痛、失眠、跌打損傷、神經衰弱等癥，療效顯著[1，15]。近年研究發現延齡草具有抗腫瘤、抗炎、鎮痛、凝血以及免疫調節等多種藥理作用，因其抗腫瘤活性顯著而倍受關注，甾體皂苷是其主要活性成分[2]，而工藝研究鮮見文獻報道。

本研究對延齡草總皂苷的提取純化工藝進行考察，前期比較超聲提取和回流提取方法，結果發現，超聲法和回流法提取效率相差不大，但超聲波提取法可以縮短提取時間、提高效率高、減少操作步驟，最終選用超聲提取法。采用正交實驗和大孔吸附樹脂法確定總皂苷最佳工藝：80%乙醇超聲提取40 min，料液比1：50，提取溫度60 ℃，提取物調至濃度為4.28 mg·mL-1濃度的延齡草皂苷，經D101大孔樹脂，上樣體積4 BV，用3 BV水洗脫除雜，4 BV 75%乙醇洗脫，收集75%乙醇部位即得。在此優化條件下將延齡草總皂苷的含量平均提高8.0倍，達到61.45%，平均回收率為92.08%。

對最佳工藝得到的延齡草總皂苷進行了抗腫瘤活性研究。體外實驗表明總皂苷對MCF-7、Hela和A549腫瘤細胞具有一定的抑制作用，其中對MCF-7、HeLa細胞的抑制作用較為顯著。通過S180小鼠移植瘤模型研究發現，總皂苷各劑量組可明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，降低荷瘤小鼠腫瘤質量，且大劑量組抑瘤率與環磷酰胺相當。腫瘤的發生、發展與機體的免疫功能失調密切相關。在致瘤因素的作用下，機體免疫功能下降會使腫瘤細胞獲得更多的生長機會，而當增強機體免疫功能時，腫瘤細胞的生長則可受到限制[16]。胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，其臟器指數是衡量機體免疫功能的初步觀察指標。本研究發現延齡草總皂苷各劑量組可以提高荷瘤小鼠的脾臟指數和胸腺指數，說明總皂苷對免疫器官具有一定的保護作用。而環磷酰胺組脾指數和胸腺指數均顯著降低，表明其對免疫系統具有明顯抑制作用。

綜上所述，經提取純化得到的延齡草總皂苷純度較高，工藝穩定，藥效實驗證明，其具有良好的抗腫瘤作用，且沒有常見化療藥抑制免疫系統的副作用，可提高機體免疫功能，具有良好的開發前景。