超高效液相色譜法同時檢測丹參中14種水溶性成分*

李垚，楊德智，蘇斌，杜冠華，呂揚

(1.北京協和醫學院中國醫學科學院藥物研究所晶型藥物研究北京市重點實驗室，北京 100050；2.山東濟世藥業有限公司，萊蕪 271100；3.北京協和醫學院中國醫學科學院藥物研究所藥物靶點研究和新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050)

丹參是唇形科植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bre.)的干燥根及根莖[1]，是我國一種傳統中藥材，應用歷史悠久，用途廣泛。據《神農本草經》記載，丹參主治“心腹邪氣”，能夠“破癥除瘕，止煩滿，益氣”[2]，《本草綱目》記載丹參還具有“活血，通心包絡，治疝痛”[3]等功效。20世紀30年代以來，通過對丹參成分組成的研究發現丹參中100多種物質，并且經過進一步藥理實驗挖掘出丹參水溶性成分抗氧化、抗菌和治療心腦血管疾病的作用[4-7]，考察山東省萊蕪市丹參藥材的直徑和丹參植株的部位對其水溶性成分含量和分布的影響，能夠為道地產區的丹參藥材的篩選，丹參莖葉資源的利用最大化提供參考。丹酚酸類成分結構單元多為丹參素與咖啡酸，結構相似，難以分離[8]，故可以同時測定14種水溶性成分的方法鮮見報道，目前測定丹參水溶性成分一般采用高效液相色譜(HPLC)法，當分離的水溶性成分較多時，每個樣品運行時間會達到60～70 min[9-13]，這不僅不能用于大量樣品的檢測，還會造成更多資源的浪費。筆者采用超高效液相色譜(UPLC)法，建立同時測定丹參中14種水溶性成分的檢測方法，大大縮短檢測時間，節約資源，為丹參中多種水溶性成分的快速檢測提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Acquity H-classUPLC(美國Waters公司)包括低壓四元溶劑系統、自動進樣恒溫樣本管理器、光電二極管矩陣檢測器、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)Empower3色譜工作站；XS-106DU電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.01 mg)；BL15-60AA超聲波清洗機(無錫沃信儀器制造有限公司)；RE-52AAC旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；YJ-100中藥粉碎機(濟南億健醫療設備有限公司)；DHG鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；DZF真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；調溫電熱器(南通利豪實驗儀器有限公司)。

1.2試藥與試劑 乙腈(色譜純，美國Honeywell Burdick﹠Jackson公司，批號：S15A1H)；乙酸(色譜純，美國TEDIA公司，批號：17040594)；純化水(杭州娃哈哈集團有限公司，批號：20180324)。標準物質或對照品：丹參素鈉(批號：110855-201412，含量：98.1%)、原兒茶酸(批號：110809-201205，含量：99.9%)、丹酚酸B(批號：111562-201716，含量：94.1%)、迷迭香酸(批號：111871-201404，含量：90.5%)購自中國食品藥品檢定研究院；原兒茶醛[GBW09553，含量：(99.8±0.4)%)]、咖啡酸[GBW09529，含量：(99.5±0.7)%]、阿魏酸[GBW09518，含量：(99.8±0.5)%]、異阿魏酸[GBW09574，含量：(99.7±0.4)%]、丹酚酸A[含量：(99.1±0.4)%]購自中國醫學科學院藥物研究所；9?丹酚酸B單甲酯(批號：MUST -17060205，含量：99.16%)、9’丹酚酸B單甲酯(批號：MUST-171114055，含量：99.38%)、丹酚酸C(批號：MUST- 17031402，含量：99.90%)、紫草酸(批號：MUST-17053003，含量：99.58%)、丹酚酸B二甲酯(批號：MUST-17041614，含量：90.04%)購自成都曼斯特生物科技有限公司。

不同批次的丹參樣品分別購買自山東省萊蕪市艾山、九龍、羅漢峪、密埠等地。經中國醫學科學院藥物研究所馬辰研究員鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBre.的干燥根及根莖。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫30 ℃；進樣量：1 μL；檢測波長286 nm；流動相：0.5%乙酸溶液(A)-乙腈(B)，流速：0.6 mL·min-1，梯度洗脫：0～1.02 min，90%→80%A；>1.02～4.08 min，80%→72%A；>4.08～4.76 min，72%→55%A；>4.76～5.50 min，55%→90%A；>5.50～8 min，90%A。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 分別稱取丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、9?丹酚酸B單甲酯、9′丹酚酸B單甲酯、丹酚酸B二甲酯約10 mg，精密稱定，加入80%甲醇溶液溶解并定容至10 mL，得到濃度依次為1.126，0.944，1.06，1.011，1.010，1.020，0.962，0.973，0.982，0.968，0.996，1.049，1.067，0.904 mg·mL-1的各對照品溶液作為儲備液，其中原兒茶酸、丹酚酸C、9?丹酚酸B單甲酯、9′丹酚酸B單甲酯、丹酚酸B二甲酯稀釋10倍后作為對照品溶液，其余10種成分將儲備液作為對照品溶液。精密量取上述儲備液各1 mL至25 mL量瓶中，以80%甲醇溶液定容，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 稱取樣品粉末[過三號篩(50目，孔徑355 μm±13 μm)]約1 g，精密稱定，置于250 mL錐形瓶中，準確加純化水100 mL，加熱回流4 h，冷卻過濾后將續濾液減壓濃縮，放冷，并定容至25 mL，搖勻，即得。

2.3方法學驗證

2.3.1專屬性實驗 取“2.2”項下對照品溶液與供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，見圖1。

2.3.2線性關系考察 分別取“2.2.1”項下各儲備液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL至50 mL量瓶中，定容，搖勻，得到5份梯度濃度的混合對照品溶液，按“2.1”中色譜條件進行分析，以各成分濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到14種水溶性成分的線性方程及范圍，見表1。

1.丹參素鈉；2.原兒茶酸；3.原兒茶醛；4.咖啡酸；5.阿魏酸；6異阿魏酸；7.迷迭香酸；8紫草酸；9丹酚酸B；10.丹酚酸A；11.9?丹酚酸B單甲酯；12.9′丹酚酸B單甲酯；13.丹酚酸C；14.丹酚酸B二甲酯。

圖1 混合對照品(A)與丹參樣品(B)的UPLC圖

1.salvianic acid A sodium；2.protocatechuic acid；3.protocatechuic aldehyde；4.caffeic acid；5.ferulic acid；6.isoferulic acid；7.rosmarinic acid；8.alkannic acid；9.salvianolic acid B；10.salvianolic acid A；11.9?saltanoic acid B monomethyl ester；12.9'salvianolic acid B monomethyl ester；13.salvianolic acid C；14.salvianolic acid B dimethyl ester.

Fig.1UPLCchromatogramofmixedreferencesubstance(A)andRadixSalviaeMiltiorrhizaesample(B)

2.3.3精密度實驗 取“2.2.1”項下對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測得峰面積，14種成分RSD值處于0.19%～1.81%，小于2%，表明儀器精密度良好。

2.3.4穩定性實驗 取上述“2.2.2”項下供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h進樣測定峰面積，14種成分在各時間點的峰面積的RSD值處于0.57%～0.51%，小于2%，證明供試品溶液穩定性良好。

2.3.5重復性實驗 取樣品2(羅漢峪直徑0.1～0.5 cm的丹參藥材樣品)，按照“2.2.2”項方法制備6份供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄各成分峰面積，14種成分平均含量RSD值處于0.04%～1.24%，小于2%，表明方法重復性良好。

2.2.6回收率實驗 稱取樣品2約0.5 g，精密稱定，共稱取6份，分別按照已知質量分數的100%，分別加入14種成分對照品，按照“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按照“2.1”項色譜條件進樣檢測，計算各成分回收率，結果見表2。

2.3.7樣品測定結果 分別取丹參的不同直徑的樣品(樣品1-9，其中1-3號產自羅漢峪，4-6號產自艾山，7-9號產自密埠)、不同部位的樣品(樣品10-24，其中10-14號產自羅漢峪，15-19產自艾山，20-24號產自九龍)按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，每份樣品制備3份，按照“2.3”項下色譜條件進樣檢測，記錄各成分峰面積，按照外標法計算含量，不同直徑丹參根中14種水溶性成分的平均含量見表3，丹參不同部位中14種水溶性成分的平均含量見表4～6。

表1 線性方程及范圍

表2 14種水溶性成分回收率試驗結果

Tab.2Resultsofrecoverytest14hydrophiliccomponentsn=6

成分名稱樣品量加入量測得量mg平均回收率/%丹酚酸A0.3250.3240.652100.93原兒茶醛0.2600.2600.522100.77咖啡酸0.0200.0200.039698.00阿魏酸0.2350.2350.46898.15異阿魏酸0.6700.6681.32798.35丹參素納3.8153.8177.647100.39原兒茶酸0.0050.0050.010100.00丹酚酸B15.71515.71231.41999.95迷迭香酸0.7650.7651.51798.30丹酚酸C0.0100.0100.0201101.00紫草酸0.9850.9831.968100.009′丹酚酸B單甲酯0.0450.0450.089498.679?丹酚酸B單甲酯0.0450.0450.090100.00丹酚酸B二甲酯0.1000.0100.0201101.10

3 討論

3.1色譜條件 通過查閱文獻[9-16]發現，測定丹參中水溶性成分的色譜條件中，流動相的有機相多為乙腈或者甲醇，非有機相多為乙酸溶液或磷酸溶液，柱溫集中在20～40 ℃，波長范圍在200～290 nm，為探求最合適的色譜條件，筆者對流動相(甲醇-0.5%乙酸溶液、乙腈-0.5%乙酸溶液、乙腈-0.1% 磷酸溶液)、波長(210，254，286 nm)、柱溫(20，30，35 ℃)進行考察，當流動相為甲醇-0.5%乙酸溶液時，所測成分間的分離度較低，當流動相為乙腈-0.1% 磷酸溶液時，酸性較大的成分(如丹酚酸A)易產生拖尾，而流動相為乙腈-0.5%乙酸溶液時，峰形與分離度均較為理想；當波長為210 nm時，溶劑效應顯著，當待測成分含量較低時易被溶劑峰掩蓋，而波長為254 nm時，大部分成分的紫外吸收值變小，有些成分響應值甚至減小到286 nm下的一半，所以選定波長為286 nm；當柱溫為20 ℃時，色譜峰出現前延，當柱溫為35 ℃時，出峰時間太短，分離度欠佳，故最終選擇的柱溫為30 ℃；結合上述考察結果最終確定當流動相為乙腈-0.5%乙酸溶液，檢測波長為286 nm，柱溫30 ℃時各成分的分離效果及峰形最好。

3.2不同直徑與部位對丹參藥材中水溶性成分含量的影響 本文對產自羅漢峪、艾山、密埠的不同直徑和不同部位的丹參藥材進行提取分析，探索了不同直徑和不同部位的丹參中水溶性成分的種類和含量，并采用了兩因素析因設計的方差分析，探究了丹參直徑和部位與水溶性成分含量之間的相關關系和影響因素間的交互作用。

表3 不同直徑丹參根含量測定結果

Tab.3Resultsofcontentdeterminationofsalviamiltiorrhizarootwithdifferentdiametermg·g-1，n=3

樣品編號丹參根編號(直徑/cm)1(≤0.1)2(0.1～0.5)3(0.5～1.0)4(≤0.1)5(0.1～0.5)6(0.5～1.0)7(≤0.1)8(0.1～0.5)9(0.5～1.0)丹酚酸A0.110.500.380.650.650.430.441.430.69原兒茶醛0.020.040.050.020.520.050.781.110.85咖啡酸0.070.060.060.020.040.030.050.050.00阿魏酸0.220.330.300.360.470.380.310.450.28異阿魏酸0.771.230.990.571.341.030.861.180.89丹參素納3.574.584.566.117.636.224.086.844.29原兒茶酸0.120.190.180.100.010.150.180.010.15丹酚酸B17.9234.8032.9831.6931.4334.4621.4433.6631.38迷迭香酸0.221.151.021.611.531.250.991.730.92丹酚酸C0.020.030.030.030.020.030.030.050.05紫草酸0.821.384.681.861.971.311.262.271.319′丹酚酸B單甲酯0.040.030.000.050.090.000.080.230.309?丹酚酸B單甲酯0.000.030.000.020.090.000.050.230.25丹酚酸B二甲酯0.260.090.070.170.200.180.280.540.69總量24.1844.4345.2843.2846.0045.5130.8449.7842.06

表4 羅漢峪丹參不同部位含量測定結果

Tab.4ResultsofcontentdeterminationofdifferentpartsofsalviamiltiorrhizafromLuohanyumg·g-1，n=3

成分羅漢峪丹參編號和部位10根11莖12葉13木質部14周皮丹酚酸A1.040.031.090.161.11原兒茶醛1.250.290.670.470.21咖啡酸0.320.390.850.030.03阿魏酸0.400.230.590.180.44異阿魏酸1.350.351.030.641.34丹參素鈉9.151.937.682.866.38原兒茶酸0.150.180.180.000.00丹酚酸B36.110.422.824.9718.18迷迭香酸0.410.372.080.401.82丹酚酸C0.120.030.030.030.12紫草酸1.470.322.290.731.889′丹酚酸B單甲酯0.090.000.080.030.219?丹酚酸B單甲酯0.190.030.470.030.11丹酚酸B二甲酯0.691.200.610.510.98總量42.745.7320.4611.0132.80

表5 艾山丹參不同部位含量測定結果

Tab.5ResultsofcontentdeterminationofdifferentpartsofsalviamiltiorrhizafromAishanmg·g-1，n=3

成分艾山丹參編號和部位15根16莖17葉18木質部19周皮丹酚酸A0.280.110.140.562.19原兒茶醛0.660.381.980.991.21咖啡酸0.250.560.810.030.03阿魏酸0.210.280.520.360.44異阿魏酸0.780.560.460.991.16丹參素鈉4.442.855.825.839.08原兒茶酸0.150.240.350.080.00丹酚酸B37.872.431.4716.8933.63迷迭香酸0.181.181.811.191.68丹酚酸C0.030.030.030.030.08紫草酸0.920.621.232.012.469′丹酚酸B單甲酯0.070.030.000.330.289?丹酚酸B單甲酯0.120.130.000.060.19丹酚酸B二甲酯0.400.560.861.082.44總量46.349.9415.4730.4354.88

3個產地共27份樣品的分析結果表明，相同產地不同直徑的丹參藥材中，直徑范圍在0.1～0.5 cm的丹參中各水溶性成分含量最高，統計數據顯示直徑是影響14種水溶性成分含量的重要因素(除紫草酸和丹酚酸C以外，其余成分方差分析的F>3.8，P<0.05)，且3個產地的樣品均呈現此規律。在所有直徑范圍內的丹參樣品中丹酚酸B含量最高，其次是丹參素，9?丹酚酸B單甲酯與9’丹酚酸B單甲酯則含量都比較低。

表6 九龍丹參不同部位含量測定結果

Tab.6ResultsofcontentdeterminationofdifferentpartsofsalviamiltiorrhizafromJiulongmg·g-1，n=3

成分羅漢峪丹參編號和部位20根21莖22葉23木質部24周皮丹酚酸A2.010.040.170.081.17原兒茶醛1.480.060.470.180.74咖啡酸0.410.220.800.030.05阿魏酸0.510.170.550.230.33異阿魏酸1.380.320.490.901.17丹參素鈉8.132.144.384.464.75原兒茶酸0.230.200.470.050.00丹酚酸B31.330.991.3017.9534.02迷迭香酸0.610.250.831.191.12丹酚酸C0.200.000.000.030.08紫草酸2.230.150.921.901.619′丹酚酸B單甲酯0.320.000.000.030.339?丹酚酸B單甲酯0.370.000.000.090.28丹酚酸B二甲酯0.560.082.100.671.28總量49.764.6212.4627.7846.94

3個產地共45份樣品的統計數據分析表明，相同產地丹參不同部位的各水溶性成分含量存在顯著差異(F>10.0，P<0.05)。從具體成分來看，根中最多成分是丹酚酸B，其含量是莖中的50倍，葉中的10～20倍；莖葉中丹參素所占比例最高，含量最大可達7.86 mg·g-1。在所檢出14種水溶性成分中，原兒茶酸、咖啡酸、迷迭香酸和紫草酸的含量從多到少依次為葉、根、莖，其中葉中迷迭香酸的含量達到了根莖含量的5～10倍，丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、9?丹酚酸B單甲酯、9’丹酚酸B單甲酯、丹酚酸B二甲酯的含量以及所有成分的總量從多到少依次為根、葉、莖，其中根的丹參素含量是莖中的4倍，是葉中1.5～2倍。周皮中各成分的含量均大于木質部，此外原兒茶酸主要存在于木質部，周皮中含量為零，丹酚酸A在周皮中的含量是木質部中4～10倍，周皮中的水溶性成分總量大于木質部。

丹參的部位和根的直徑會影響到丹參中水溶性成分的含量，直徑為0.1～0.5 cm丹參根所含各種水溶性成分均較高，總量上也表現出優勢，莖葉中水溶性成分總量大大低于根，除丹參素外，其余單個成分含量也低于根；羅漢峪和艾山的樣品中，丹參根的周皮較之木質部在水溶性成分的含量上表現出明顯的優勢，這也與其0.1～0.5 cm直徑范圍內，比表面積大，水溶性成分含量高的現象相對應，至于須根(直徑小于0.1 cm)為什么沒有表現出該優勢，推測可能是須根作為土壤中吸收水分和養分的最前沿，不能有效儲存合成的有機物，而是將其輸送到了主根及其他部位[17]。

使用UPLC法同時檢測14種水溶性成分，經方法學驗證后證明該方法分離度好，靈敏度高，定量準確，同時具有分析時間短，節約資源的優點，可為丹參資源的開發利用和質量控制提供參考。