花臉香蘑8個菌株液體菌種比較研究*

張國利，吳光宗，2，王光遠，王 潼，隋文靜，田雪梅**

（1.青島農業大學山東省應用真菌重點實驗室，山東 青島 266109；2.青島農業大學植物醫學學院，山東 青島 266109）

花臉香蘑 [Lepista sordida(Schum.:Fr.)Sing.]，屬于擔子菌門 （Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 口蘑科 （Tricholomataceae） 香蘑屬（Lepista），是一種珍稀食（藥）用菌[1]。新鮮的花臉香蘑菌肉呈淺紫色，菌蓋呈淺紫色或藕粉色，有香氣散發，故又稱其為香蘑，也稱紫晶香蘑、丁香蘑、花臉蘑等[2]。該菌蛋白質含量高，必需氨基酸種類齊全，含有豐富的具有抗氧化，增強免疫，抗衰老的硒、鍺、鋅、鐵等人體必需微量元素，具有養血、益神、補肝和益五臟之功效，常食有利于治療貧血崩漏、久病體虛、神疲、健忘等癥，能使肌體及時排毒并增加食欲，令人充滿活力[3]。花臉香蘑氣味濃香，色澤宜人，味道鮮美，鮮食、干食風味俱佳，是開發價值很高的優良珍稀食（藥）用菌。目前花臉香蘑主要以野生為主，但數量稀少且隨環境條件變化有日益枯竭的趨勢。自2000年以來，國內福建、貴州等地陸續有少量花臉香蘑人工馴化栽培的報道出現[4]，但有關花臉香蘑液體菌種的研究尚未見報道。

液體菌種與傳統固體菌種相比，具有發菌時間短、菌種活力高、發菌點多、成本低等諸多優點，越來越多地被用于食用菌研究開發中[5]。從應用和開發的角度出發，通過對花臉香蘑8個菌株液體菌種培養過程中的發酵液pH、菌絲生物量及3種胞外酶活性進行跟蹤測定和分析，以期為花臉香蘑人工馴化栽培及進一步開發利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

花臉香蘑8個菌株，編號分別為Ls1～Ls8，由山東省應用真菌重點實驗室分離并保藏。

1.2 液體發酵條件

500 mL三角瓶，裝液量200 mL，接種量5%，150 r·min-1，25℃避光振蕩培養 8 d[9]。

1.3 測定項目

接種后第4天～第8天，8個菌株每天定瓶定時取20 mL發酵全液，PHS-3C型pH計測定發酵液pH并記錄。200目紗網過濾，所得菌球于50℃烘至恒重，計算菌絲生物量，所得濾液5 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液，測定其胞外羥甲基纖維素酶、半纖維素酶和漆酶活性，每組3個重復。

1.4 胞外酶活性測定

1.4.1 羥甲基纖維素酶活力測定

將 1%CMC-Na溶液 0.95 mL 與粗酶液 0.05 mL 充分混勻；40℃水浴30 min后立即加入DNS 1.50 mL，沸水浴5 min；冷卻后蒸餾水定容到12.50 mL，混勻；540 nm下測OD值，另取同樣酶液沸水浴5 min滅活作為對照組。每個樣品3個重復[6]。葡萄糖含量測定標準曲線y=1.263 8x-0.003，R2=0.999 1。上述條件下，每毫升粗酶液每分鐘產生1 μg葡萄糖所需酶量定義為1個酶活力單位（U·mL-1）。

1.4.2 半纖維素酶活力測定

用 pH 4.8 的 0.2 mol·L-1Na2HPO4-C6H8O7緩沖液將粗酶液稀釋10倍，吸取0.25 mL至試管中，準確取 10 mg·mL-1的木聚糖 0.75 mL放入試管中；50℃水浴30 min后立即加入DNS 1.50 mL，沸水浴5 min；冷卻后定容到12.50 mL，540 nm下測定OD值；另取同樣酶液沸水浴5 min滅活作為對照組，每組設置3個重復[7]。木糖含量測定標準曲線y=1.571x+0.009 8，R2=0.999 3。每毫升粗酶液每分鐘產生1 μg木糖所需酶量定義為1個酶活力單位（U·mL-1）。

1.4.3 漆酶活性測定

漆酶活性測定采用ABTS法，5 mL的酶活反應體系中，加入 0.5 mmol·L-1的 ABTS 2.0 mL，再加入用 0.2 mol·L-1Na2HPO4-C6H8O7緩沖液稀釋 7.5 倍的粗酶液3.0 mL。將底物與酶液混勻后啟動反應，每隔3 min記錄420 nm處吸光值的變化。每個樣品3個重復，用沸水浴滅活的粗酶液作對照[8]。每分鐘轉化1 μmol ABTS使產物ABTS自由基濃度變化的值定義為1個漆酶單位（U，U·mL-1）。計算公式如下：

式中：△A為連續2次吸光值的差值；V為反應體系總體積；ε=3.6×104L·mol-1·cm-1；L為比色皿直徑；t為反應時間；v為樣品體積。

2 結果與分析

2.1 不同花臉香蘑菌株發酵液pH變化情況

測定不同花臉香蘑菌株發酵液pH變化情況，結果見圖1。

圖1 不同花臉香蘑菌株發酵液pH變化情況Fig.1 The pH change in fermentation broth of different Lepista sordida strains

由圖1可知，8個菌株液體菌種培養的起始pH為6.10，后隨培養的進行pH逐漸下降，在培養的第8天下降至pH 5.60左右，菌株之間無明顯差異。

2.2 不同花臉香蘑菌株菌絲生物量變化情況

測定不同花臉香蘑菌株菌絲生物量變化情況，結果見圖2。

圖2 不同花臉香蘑菌株菌絲生物量變化情況Fig.2 Changes in mycelium biomass of different Lepista sordida strains

由圖2可知，隨培養時間的增加，參試各菌株菌絲生物量均表現出明顯的上升趨勢，從培養的第6天開始，增速變緩。其中，菌株Ls5和菌株Ls3的菌絲生物量始終高于其他6個菌株，在培養的第8天均在8.60 g·L-1以上，其他菌株的生物量則集中在6.60 g·L-1～8.10 g·L-1之間。

2.3 不同花臉香蘑菌株胞外羥甲基纖維素酶活性測定

羥甲基纖維素酶在花臉香蘑菌絲的營養生長階段，對于碳源的提供起到重要的作用。測定不同花臉香蘑菌株胞外羥甲基纖維素酶活性，結果見圖3。

圖3 不同花臉香蘑菌株胞外羥甲基纖維素酶活性測定Fig.3 Determination of extracellular hydroxymethyl cellulase activity of different Lepista sordida strains

由圖3可知，供試各花臉香蘑液體菌種在培養過程中均可產生羥甲基纖維素酶，多數菌株從培養的第5天開始，羥甲基纖維素酶活力基本維持在30.00 U·mL-1～60.00 U·mL-1。菌株 Ls3 在培養的第 8天時羥甲基纖維素酶活力最高值達到93.02 U·mL-1，其次是菌株Ls7。在培養的第7天，除菌株Ls3和菌株Ls7羥甲基纖維素酶活力增長加快之外，其他菌株的酶活力基本趨于穩定。根據上述試驗結果，在培養的第7天～第8天作為液體菌種使用時，菌株Ls3和Ls7分解纖維素類培養料的能力最強，生產潛力大。

2.4 不同花臉香蘑菌株胞外半纖維素酶活性變化情況

測定不同花臉香蘑菌株胞外半纖維素酶活性，結果見圖4。

圖4 不同花臉香蘑菌株胞外半纖維素酶活性測定Fig.4 Determination of extracellular hemicellulase activity of different Lepista sordida strains

由圖4可知，除菌株Ls7和菌株Ls6一直呈上升趨勢外，其余菌株均呈現先上升后下降的趨勢。其中，菌株Ls5和菌株Ls3的胞外半纖維素酶活力最高值出現在培養的第7天，其他4個菌株的最高值出現在培養的第6天。菌株Ls5、Ls3和Ls7在培養的第7天～第8天，半纖維素酶活力最高值均在3.11 U·mL-1以上。根據以上試驗結果推斷，在培養的第7天～第8天作為液體菌種使用時，菌株Ls5、Ls3和Ls7分解半纖維素類培養料的能力最強。

2.5 不同花臉香蘑菌株胞外漆酶活性測定

測定不同花臉香蘑菌株胞外漆酶活性，結果見圖5。

由圖5可知，菌株Ls1、Ls5和Ls3的漆酶活性始終較低且無明顯變化。其余5個菌株的漆酶活力均呈現先上升后下降的趨勢，8個菌株在培養的第6天達到最高值，隨后下降。其中菌株Ls4漆酶酶活力最高為7.79 U·mL-1，其次為菌株Ls2和菌株Ls6。因花臉香蘑屬于草腐菌，所以漆酶活力對于其對培養基質的分解能力影響較小。

圖5 不同花臉香蘑菌株胞外漆酶活性測定Fig.5 Determination of laccase activity of different Lepista sordida strains

3 結論

在液體菌種的篩選過程中，通常需要根據菌種生物量以及菌種對培養料的分解利用能力等方面進行考察。通過跟蹤測定8個花臉香蘑菌株液體菌種培養過程中發酵液pH、菌絲生物量以及胞外羥甲基纖維素酶、半纖維素酶和漆酶活力，對供試菌株進行綜合考察和篩選。

由于花臉香蘑屬草腐性真菌，因此其對于培養料的利用主要以纖維素、半纖維素類成分為主，為篩選優良液體菌種，菌絲生物量、羥甲基纖維素酶和半纖維素酶活力是主要考察因素。而漆酶作為具有分解木質素類成分功能的酶，其活力高低對于花臉香蘑利用培養料的能力有一定的輔助作用[10]。綜合本研究的各項結果，菌株Ls3的液體菌種在培養的第7天～第8天，具有較高的菌絲生物量和羥甲基纖維素酶、半纖維素酶活性，是優良的液體菌種工程菌株。當培養料中含有一定木質素類成分時菌株Ls7作為液體菌種進行使用也具有一定的優勢。該結果為花臉香蘑人工栽培技術和優良菌株選育等相關研究提供了一定的理論基礎和實踐依據，將有力促進這一珍稀食用菌品種的推廣應用。