云南黑木耳常見病害調查及病原菌分離與鑒定*

劉紹雄，劉春麗，尚陸娥，李建英，王明月，吳廣彪，羅孝坤

（1.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省供銷合作社科學研究所，云南昆明650221；3.云南省農村科技服務中心，云南 昆明 650021；4.施甸康宏農業科技發展有限公司，云南 保山 678000）

黑木耳（Auricularia heimuer）[1]，又名木耳、光木耳、黑菜[2-3]，是我國重要的食用菌栽培品種。黑木耳肉質脆嫩、味道鮮美、營養豐富，含有豐富的蛋白質、氨基酸、維生素及鈣、磷、鐵等人體所需的礦質元素[4]，被稱為“素中之葷”[2]。同時黑木耳還富含木耳多糖、黑色素、腺苷類物質和甾醇等藥用成分，具有潤肺清腸、降血糖、降血脂、抗血栓、抗輻射、抗氧化、抗腫瘤等多種功效[4-5]，享有“黑色瑰寶”的美譽，深受廣大消費者的青睞，市場前景廣闊。

黑木耳在全國范圍內廣泛栽培，尤其以東北地區為主產區。據統計，2017年我國黑木耳產量達751.85萬噸，是全國栽培產量第二大的食用菌品種，東北黑龍江和吉林兩省黑木耳產量約占全國黑木耳總產量的60%以上[6]。云南地處低緯高原，獨特的氣候條件促使云南黑木耳栽培優勢明顯。云南黑木耳栽培出耳時間多集中于10月至次年4月，在冬季相對較低的溫度和全日光條件下出耳，黑木耳品質突出，云南生產的高品質黑木耳，即云耳，享譽國內外。但云南黑木耳栽培規范化程度不高，栽培技術參差不齊，在排場出耳管理階段病害尤為嚴重，嚴重影響栽培產量和產品質量。本文中，通過對云南黑木耳排場出耳管理階段病害嚴重的保山地區基地，開展常見病害調查及病原菌分離鑒定研究，分析病害發生原因及病原鑒定，以期能為云南黑木耳栽培管理及病害防治提供理論依據，為篩選抗病性強的優良菌株提供供試菌株材料。

1 材料與方法

1.1 采樣點概況及樣品采集

1.1.1 采樣點概況

以云南黑木耳排場出耳管理階段病害嚴重的保山地區基地西邑 （E：99°29′41″，N：24°9′17 ″，海拔 1 656 m）、芒寬 （E：98°8′8″，N：25°53′9 ″，海拔738 m），作為病害調查和病原菌采集樣點。

1.1.2 樣品采集

采樣時間為2018年1月～3月，采集黑木耳染病的菌棒基質和耳片。共采集病害樣品9份，對采集的樣品進行編號，放入冰盒中保存帶回實驗室進行病原菌分離。同時詳細記錄采集地點、采集時間、發病時間、病害癥狀特點等。

1.2 病原菌分離、純化與鑒定

1.2.1 培養基

PDA培養基：馬鈴薯（去皮） 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 15 g～20 g，蒸餾水 1 000 mL。

孟加拉紅培養基：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀 1.0 g、硫酸鎂 0.5 g、氯霉素 0.1 g、瓊脂15 g～20 g，1/3 000孟加拉紅溶液100 mL，蒸餾水1 000 mL。

LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、瓊脂15 g～20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2.2 菌種分離與純化

1）細菌性病原菌的分離、純化

培養基：LB培養基。在超凈無菌工作臺內，用接種針在爛耳耳片上輕輕蘸一下，在培養基平板上劃線，置于37℃恒溫培養箱中培養，培養12 h～24 h后蘸取單菌落于平板上進行純化后，于4℃冰箱中保存備用。

2）真菌性病原菌的分離、純化

培養基：PDA培養基、孟加拉紅培養基。在超凈無菌工作臺內，從染病的菌棒基質上直接挑取一小塊置于培養基平板上，置于25℃培養箱中培養。培養3 d～5 d挑取病原菌邊緣菌落至平板上進行純化后，于4℃冰箱中保存備用。

1.2.3 菌株鑒定

細菌采用16S rDNA序列分析[7]，真菌采用rDNA ITS序列分析[8-9]，樣品送昆明碩擎生物科技有限公司測序，用DNAMAN進行序列拼接，從GenBank中獲取與該菌株序列同源性較高的部分菌株序列，并用BioEdit進行序列對齊，最后用MEGA 4軟件進行系統發育樹構建，以確定菌株的系統發育地位。

2 結果與分析

2.1 黑木耳常見病害調查結果

病害侵染情況見圖1。黑木耳常見病害調查結果見表1。

圖1 黑木耳病害癥狀Fig.1 Symptoms of Auricularia heimuer disease

表1 病害調查結果Tab.1 Investigation results of Auricularia heimuerdiseases

由表1可知，共采集黑木耳病害樣本9份，其中芒寬6份、西邑3份。芒寬發生病害更為嚴重。從發病發生階段來看，主要集中在刺孔催芽和排場出耳階段。

由圖1可以看出，病害癥狀主要是耳片爛耳和菌棒感染。爛耳耳片變軟，有膠質流出，逐漸腐爛，有臭味。菌棒感染表面產生霉層，侵染部分呈現綠色、紅色或白色菌皮，菌棒腐爛變軟或形成厚厚菌皮層，導致菌棒出耳較少或不出耳。從發病規律來看，主要發生在刺孔后、下地排場后或采收第一潮耳后，氣溫升高、濕度增大，起初菌棒無明顯現象，菌棒逐漸變軟，表面開始被感染，然后迅速蔓延至整個菌棒。

根據病害癥狀及發生規律分析病害發生原因：黑木耳出耳后，溫度過高，噴水過多或下雨濕度過大，耳片變軟，易被細菌性病原菌侵染，耳片逐漸腐爛，變臭；菌絲刺孔后菌絲新陳代謝加快，菌絲呼吸作用加強，菌棒內料溫升高，當環境溫度較高時，菌絲催芽期間會出現高溫燒菌，造成菌絲抗病能力下降；環境中的致病性強的病原菌會從接種孔，催芽孔進入侵染菌棒；此外，當排場下地時，黑木耳菌棒在露天條件下出耳，氣溫較高，菌棒內溫度升高，造成菌絲高溫燒菌，導致菌絲抗病能力下降或造成菌絲死亡，高溫高濕條件下，菌棒表面或菌棒底部水分過高，競爭性真菌病害侵染培養料，然后迅速蔓延侵染整個菌棒。

2.2 黑木耳病原菌分離

從每個染病黑木耳耳片或菌棒中各分離出1個病原菌，編號為AHD-01～AHD-09。分離情況詳見表2、圖2、圖3。

圖2 病原細菌菌落形態Fig.2 Colony morphology of pathogenic bacteria

圖3 病原真菌菌落形態Fig.3 Colony morphology of pathogenic fungi

表2 黑木耳病原菌分離情況Tab.2 Isolation of pathogenic bacteria from Auricularia heimuer

由表2、圖2、圖3可知，從西邑、芒寬2個采集地點采集的9個病害樣品中分離到9株病原菌菌株，黑木耳耳片爛耳病害分離得到病原細菌菌株AHD-01，從菌落形態特征來看初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus） 細菌[10]。黑木耳菌棒感染、爛棒病害分離得到8株病原真菌。其中菌株AHD-02、AHD-03、AHD-06從菌落形態特征來看初步鑒定為木霉屬（Trichoderma） 真菌[11]，菌株AHD-04、AHD-08初步鑒定為鐮刀菌屬（Fusarium） 真菌[12-14]。結合AHD-05菌株菌落形態特征和圖1-5子實體形態，初步鑒定為蠟孔菌屬（Ceriporia） 真菌[15]。AHD-07初步鑒定為節叢孢菌屬 （Arthrobotrys） 真菌[16]。AHD-09初步鑒定為耙齒菌屬（Irpex） 真菌[17]。

2.3 基于rDNA序列的病原菌系統發育分析

將病原菌菌株AHD-01的16S rDNA序列在GenBank中進行序列Blast分析，獲取同源性較高的序列構建系統發育樹，確定該菌株的系統發育地位，詳見圖4。

由圖4可知，菌株AHD-01與東洋芽孢桿菌（Bacillus toyonensis） 聚為一類，通過DNAMAN進行同源性對比對，該菌株與菌株Bacillus toyonensis（MG574860.1） 同源性達 99.51%，因此將該病原菌菌株AHD-01鑒定為東洋芽孢桿菌（Bacillus toyonensis）。

將 AHD-02、 AHD-03、 AHD-04、 AHD-05、AHD-06、AHD-07、AHD-08、AHD-09八個病原菌菌株的ITS序列在GenBank中進行序列Blast分析，獲取同源性較高的序列構建系統發育樹，確定該菌株的系統發育地位，詳見圖5。系統發育樹分析結果見下表3。

表3 基于ITS序列系統發育樹分析表Tab.3 Phylogenetic tree analysis table based on ITS sequences

圖4 基于16S rDNA序列構建的NJ系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

圖5 基于ITS序列構建的NJ系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由圖5和表3可知，AHD-02和AHD-03為側耳木霉（Trichoderma pleuroticola）。AHD-04為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。AHD-05為撕裂蠟孔菌（Ceriporia lacerata）。AHD-06為長枝木霉（Trichodermacf.longibrachiatum）。AHD-07為圓錐節叢孢菌（Arthrobotrys conoides）。AHD-08為亞粘團鐮孢菌（Fusarium subglutinans）。AHD-09為白囊耙齒菌 (Irpex lacteus）。

3 結論與討論

3.1 結論

云南黑木耳排場出耳管理階段常見病害癥狀主要是耳片爛耳和菌棒感染，主要發生在刺孔后、下地排場后或采收第一潮耳后。氣溫升高、濕度增大，起初菌棒無明顯現象，后菌棒變軟，表面逐漸被感染，迅速蔓延至整個菌棒。病害發生原因為菌棒刺孔后菌絲呼吸作用加強或露天出耳，溫度較高，菌棒內料溫升高，造成高溫燒菌，使菌絲抗病能力下降或造成菌絲死亡，競爭性真菌迅速蔓延侵染整個菌棒；露天出耳時，溫度過高，噴水過多或雨天濕度過大，耳片變軟，易被細菌性病原菌侵染導致爛耳。

通過對分離的病原菌進行rDNA序列分析表明，導致黑木耳爛耳的病原菌AHD-01為東洋芽孢桿菌（Bacillus toyonensis）。導致菌棒感染的病原菌AHD-02和AHD-03為側耳木霉（Trichoderma pleuroticola），AHD-04為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），AHD-05為撕裂蠟孔菌（Ceriporia lacerata），AHD-06為長枝木霉 （Trichodermacf.longibrachiatum），AHD-07為圓錐節叢孢菌（Arthrobotrys conoides），AHD-08為亞粘團鐮孢菌（Fusarium subglutinans），AHD-09為白囊耙齒菌 (Irpex lacteus）。

3.2 討論

閆寶松等[18]研究表明，高溫、高濕通風不良造成的細菌感染是導致爛耳的主要原因之一，本研究中發現高溫、高濕引起黑木耳爛耳的病原菌為東洋芽孢桿菌 （Bacillus toyonensis）。顏一紅[19]、劉正慧[20]、曹現濤[21]、崔紅麗[22]等研究表明，木霉屬的側耳木霉（Trichoderma pleuroticola）、長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum），節從孢屬（Arthrobotrys）、尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum） 是食用菌中主要病原真菌，在食用菌生產中易侵染菌棒導致爛棒，在香菇、木耳、平菇、杏鮑菇等食用菌栽培中極易發生，這與本研究中的結果一致。

本研究中，發現黑木耳菌棒受到撕裂蠟孔菌（Ceriporia lacerata）、白囊耙齒菌 （Irpex lacteus） 侵染后形成厚厚菌皮，這2種病原菌均為大型真菌，多生長于闊葉樹倒木、枯立木、枯枝上。本研究中黑木耳栽培樣地周圍均是森林，可能是黑木耳高溫燒菌后菌絲生長較弱或死亡，四周環境中的病原菌孢子侵染菌棒造成病害。前人研究表明，撕裂蠟孔菌能分泌藥物成分，可用于預防和治療貧血、糖尿病、胃病、癌癥和心臟病等疾病，還能用于生物造紙、農藥降解、廢水處理等，開發潛力巨大[23-28]。白囊耙齒菌制成的藥物制劑能明顯抑制慢性腎炎病人的紅細胞及尿蛋白，是一種極具有市場開發潛力的抗腎炎藥物。因此，本研究中分離獲得的撕裂蠟孔菌、白囊耙齒菌菌株可為后期菌種開發利用提供種質資源。