新疆天山山脈地區野生羊肚菌ITS分析鑒定*

易思華，張 媱，孫燕飛，李 楊，馮 麗

（石河子大學生命科學學院，新疆 石河子 832000）

羊肚菌隸屬子囊菌亞門（Ascomycotina） 盤菌綱（Discomycetes） 盤菌目 （Peziales） 羊肚菌科（Morchellaceae） 羊肚菌屬 （Morchella）[1]，是世界性分布的名貴稀有食用菌，具有較大的食用和藥用價值，因此被人們所廣泛喜愛。因其子實體菌蓋呈“蜂窩”狀，形似羊肚而得名羊肚菌[2]。

新疆天山山脈地區得天獨厚的地理條件為羊肚菌提供了良好的生長環境，擁有豐富的野生羊肚菌資源[3]。該地區野生羊肚菌分布范圍廣泛，普遍生長于海拔800 m～2 300 m的山坡、低山和中山處；生境多為針葉林、闊葉林、混交林常見的闊葉林有櫟樹、白樺、柳樹等，針葉樹主要樹種有冷杉、油杉、云杉等[4]；有時在林緣草地及河灘草地，甚至在腐朽的樹根周圍、溪邊、巖石旁等處也常常能找到羊肚菌的“蹤跡”[5]。

傳統的形態學分類方法，根據菌蓋中部與菌柄是否分離、菌蓋邊緣是否明顯向外伸展、菌蓋的形狀和顏色、菌蓋棱紋排列和凹坑的深淺等性狀，可以進行初步鑒定[6]。有關新疆野生羊肚菌的分類研究，大多采用常規形態學原理分類，但因野生羊肚菌在生長過程中子實體形態受環境影響會發生很大變化，導致了分類不準確。隨著分子生物學技術的發展，真菌分類和系統發育研究也發生了革命性的變革[7]，近年，ITS（internal transcribed spacer） 技術廣泛應用于真菌分類及系統發育的研究。菌物學家將羊肚菌屬分為三大類，即黑色羊肚菌類、黃色羊肚菌類和半開羊肚菌類[8]，而新疆野生羊肚菌已鑒定出的有小羊肚菌、高羊肚菌、羊肚菌、高柄羊肚菌、黑脈羊肚菌、離柄羊肚菌等[9]；趙震宇[10]在《新疆食用菌志》中記錄了黑脈羊肚菌，圓錐羊肚菌、羊肚菌、小羊肚菌、皺柄羊肚菌；卯曉嵐[11]在《中國大型真菌原色圖鑒》中記錄了新疆地區黑脈羊肚菌、尖頂羊肚菌、羊肚菌、粗腿羊肚菌、高羊肚菌。總體來說，文獻報道新疆地區發現并鑒定出來的野生羊肚菌大多都分布于新疆伊犁、烏魯木齊、石河子、塔城、阿勒泰、哈密地區[12-19]。本試驗中，以2016年～2018年間采自新疆石河子、呼圖壁、阜康、伊犁、沙灣地區的部分羊肚菌為材料，提取其基因組DNA，進行ITS序列比對分析，構建進化樹，深入探究了新疆野生羊肚菌菌株的種屬及分類地位，確定了新疆地區未鑒定的野生羊肚菌資源，旨在進一步明確新疆地區野生羊肚菌資源分布，以便為實現新疆地區野生羊肚菌的馴化、育種及商業化人工栽培奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 野生羊肚菌菌株及來源

2016年～2018年4下旬至6月中旬，赴新疆石河子、呼圖壁、阜康、伊犁、瑪納斯、沙灣地區采集到52株野生羊肚菌，從中選擇10株樣品進行詳細分析，依次編號為M1～M10，樣品采集地生境信息見表1。

表1 野生羊肚菌樣品采集地生境Tab.1 Habitat of wild Morchella samples

1.1.2 主要試劑

2×Easy Taq Mix（北京康為世紀生物公司）、Gold view（北京索萊寶科技有限公司）、ITS1[5’-(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)-3’]、ITS4[5’-（CAGG AGACTTGTACACGG）-3’]引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 野生羊肚菌形態學初步鑒定

觀察野生羊肚菌子實體形狀、大小、顏色和脈紋等形態特征，參照《大型真菌圖鑒》[20]，初步鑒定52份野生羊肚菌。選擇其中10株進一步進行ITS分析。

1.2.2 組織分離與純化

將10個羊肚菌子實體沖洗干凈、晾干。在超凈工作臺中，用75%酒精反復緩慢沖洗子實體30 s，后用無菌水沖洗3次，用無菌吸水紙將子實體表面水分吸干。使用無菌的手術刀片切取子實體內部組織，接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）試管斜面上，室溫、黑暗培養1周后挑取菌絲生長點部位轉接至新的PDA試管中，直至培養基中無雜菌生長，即獲得野生羊肚菌純菌絲。

1.2.3 菌株基因組DNA提取

采用CTAB改良法，從試管斜面刮取50 mg左右菌絲體于2 mL無菌EP管中，加入CTAB抽提液500 μL 與酚和氯仿-異戊醇 （24∶1） 各 250 μL，并加入適量無菌石英砂，置于280 r·min-1搖床中常溫抽提40 min；12 000 r·min-1室溫離心10 min后，小心吸取上清液600 μL于1.5 mL無菌EP管中，加入3 mol·L-1醋酸鈉 60 μL 與異丙醇 660 μL，混勻后室溫沉淀2 h；10 000 r·min-1離心5 min，棄上清；加入 70%乙醇 200 μL漂洗，10 000 r·min-1離心 5 min，棄上清；加入200 μL無水乙醇漂洗，10 000 r·min-1離心5 min，棄上清；超凈工作臺中吹干，加入無菌水30 μL溶解，冰箱-20℃保存備用。

1.2.4 ITS 區擴增及 ITS 測序

ITS-PCR擴增反應體系為20 μL：2×Easy Taq Mix 10 μL、ITS1和 ITS4 引物各 1 μL、模板 DNA 2 μL、ddH2O 6 μL。PCR程序設定為：預變性，94℃，10 min；變性，94℃，1 min；退火，56℃，45 s；延伸，72℃，1 min；延伸，72℃，10 min；30個循環。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，使用凝膠成像儀拍照，最后將PCR產物送生物技術公司測序。

1.2.5 構建系統進化樹

利用 MEGA 6.0、Align by-ClustalW 程序進行多序列比對，手動刪除不合群序列[21]，選擇Neighbor-Joining法構建進化樹[22]，選擇Bootstrp method作為構建進化樹的檢驗方法[23]，檢驗次數設置為1 000，遺傳距離計算模型設置為p-diatance,選擇pairwise處理序列中的空位與缺失，得出構建的進化樹。

2 研究結果與分析

2.1 野生羊肚菌子實體形態特征

野生羊肚菌子實體形態特征見圖1。

圖1 野生羊肚菌子實體性狀Fig.1 Wild Morchella sporocarp characters

如圖1所示，野生羊肚菌的生長對周圍環境條件要求極為苛刻，由于新疆不同地區氣候差異較大，采集自新疆石河子、呼圖壁、阜康、伊犁、瑪納斯、沙灣地區的羊肚菌子實體形態也各有差異。

對初步分類所得的10株野生羊肚菌進行子實體特征描述，詳見表2。

如表2所示，樣品M3、M4、M8的菌蓋形狀為球狀，頂端呈橢圓狀；樣品M2、M3、M4、M5、M6、M7的菌蓋顏色均為黑色，樣品M1、M8、M9、M10的菌蓋顏色均為黃色，10個樣品菌蓋與菌柄長度比基本一致。

2.2 ITS擴增分析

根據Wipf[24]等對黃色羊肚菌和黑色羊肚菌ITS序列的研究，可知黑色羊肚菌的ITS序列長度在740 bp～750 bp之間；黃色羊肚菌的ITS序列長度在1 150 bp～1 220 bp之間。10個樣品的PCR檢測結果見圖2。

由圖2可知，本試驗中樣品M8、M9、M10在1 100 bp左右有明亮且清晰的條帶；樣品M6、M7在750 bp左右有明亮且清晰的條帶，與Wipf所報道的結果基本一致。

2.3 進化樹分析

樣品的系統發育樹見圖3。

表2 野生羊肚菌樣品形態特征Tab.2 Morphological characteristics of wild Morchella samples

圖2 野生羊肚菌樣品ITS片段檢測結果Fig.2 Amplified ITS fragment of wild Morchella samples

圖3 基于ITS序列構建的羊肚菌菌種間系統發育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of Morchella species based on ITS sequences

如圖3所示，以皺蓋鐘菌（Verpa bohemica） 作為外群，進化樹的根部分支出黑色羊肚菌支系（group 1）、黃色羊肚菌支系（group 2） 和外群3支。通過系統發育樹分析，羊肚菌M8、M9、M10均聚類在黃色羊肚菌支系（group 2） 上，即推斷其都屬于黃色羊肚菌。其中羊肚菌M8以76%的Bootstrap聚在羊肚菌（Morchella Mes-X） 分支上，說明M8的ITS序列與羊肚菌極為相似，而羊肚菌屬于黃色羊肚菌，由此可進一步確定M8為黃色羊肚菌[25]。羊肚菌M9以100%的Bootstrap聚在美味羊肚菌（Morchella esculenta）分支上，說明它們之間親緣關系較近，可確定羊肚菌M9就是美味羊肚菌。編號為M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7的羊肚菌均聚類在黑色羊肚菌支系（group 1） 上，它們都屬于黑色羊肚菌。其中采自沙灣鹿角灣地區的羊肚菌M7以81%的Bootstrap聚在高羊肚菌（Morchella elata)分支上，可確定M7是高羊肚菌；羊肚菌M5以100%的Bootstrap聚在黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps)分支上，可確定M5是黑脈羊肚菌。采自阜康地區的羊肚菌M6以100%的Bootstrap聚在梯棱羊肚菌（Morchella importuna)分支上，表明M6的ITS序列與梯棱羊肚菌的ITS序列之間差異很小，可確定羊肚菌M6為梯棱羊肚菌。

3 討論

目前，傳統經典形態分類學方法已經非常完善了，但因羊肚菌的生長對周圍生長環境條件極其敏感，子實體形態不一，使用傳統經典形態分類學以及單一的ITS序列鑒定常常不準確，因此要求我們尋求更多更可靠的辦法為羊肚菌的分類研究提供新的更可信的依據，該結論在韓鵬遠等[26]在山西中南部地區羊肚菌資源研究中也得到證實，現在可采用rpb1、rbp2、ef1-α等多基因片段聯合，進行野生羊肚菌更加準確的物種界定[27]。

本試驗采自伊犁察布查爾縣地區的野生羊肚菌M5是黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps)，鑒定結果與武冬梅采自伊犁察布查爾縣的羊肚菌一致；目前新疆石河子采集并鑒定的野生羊肚菌有2種，即尖頂羊肚菌、黑脈羊肚菌，本試驗采自石河子不同地區的野生羊肚菌M9鑒定為美味羊肚菌（Morchella esculenta），該種羊肚菌在新疆石河子地區從未報道過。

新疆北部地區各地特殊的小氣候為羊肚菌的發生提供了良好條件，因此新疆地區成為了我國羊肚菌資源和種類最豐富的地區之一，羊肚菌產業在新疆地區具有巨大潛力。目前，對新疆地區羊肚菌的研究正處于探索階段，深入而廣泛的野生羊肚菌資源調查是非常必要的。

4 結論

本試驗中采用傳統經典形態學分類與核糖體DNA轉錄間隔區（ITS） 序列分析技術結合的方法，確定羊肚菌M8（MK752768）、M10（MK757602） 均屬于黃色羊肚菌，M9（MK757633）是美味羊肚菌；羊肚菌 M1（MK757636）、M2（MK757644）、M3（MK757642）、M4（MK757646） 均屬于黑色羊肚菌。M5 （MK757657） 是黑脈羊肚菌；M6 （MK757608）是梯棱羊肚菌；M7（MK757626）是高羊肚菌，新疆天山山脈地區野生羊肚菌資源豐富。