裂褶菌液體菌種培養(yǎng)技術(shù)研究

馬布平，李朝東，聞紹峰，曹 瑤，陳孟迪，羅祥英

（云南菌視界生物科技有限公司，云南 昆明 650200）

裂褶菌（Schizophyllum communeFr.），俗稱白參，屬于傘菌目（Agaricales） 裂褶菌科（Schizophyllaceae） 裂褶菌屬 （Schizophyllum）[1]。野生資源分布廣，食用價(jià)值高，但隨著生活水平提高，野生裂褶菌的口感已不符合市場需求，人工栽培的裂褶菌在口感上得到很大的改善，且克服了子實(shí)體單生、細(xì)小的缺點(diǎn)。

國內(nèi)裂褶菌相關(guān)研究始于20世紀(jì)80年代，歷經(jīng)二十多年。2006年，在福建省古田縣實(shí)現(xiàn)了裂褶菌商業(yè)化栽培，發(fā)展速度慢[2]。2017年，本課題組進(jìn)行了裂褶菌工廠化栽培技術(shù)研究，并取得一定成果，但相對于金針菇、杏鮑菇等成熟的工廠化栽培品種來看，裂褶菌工廠化栽培需要探索的內(nèi)容還很多，首要急需解決的是液體菌種的生產(chǎn)。

近年來，裂褶菌多糖成為研究熱點(diǎn)，在抗腫瘤、護(hù)膚等方面有所進(jìn)展，也有相應(yīng)的產(chǎn)品出現(xiàn)，比如抗腫瘤藥物“Sizofiran”及護(hù)膚產(chǎn)品“IOPE”[3]。裂褶菌多糖主要是從發(fā)酵液中獲得菌絲，利用熱水法、超聲波法實(shí)現(xiàn)多糖提取[4]，而關(guān)于裂褶菌液體發(fā)酵的相關(guān)研究較少，無系統(tǒng)的介紹。通過本試驗(yàn)，希望可以為裂褶菌深層發(fā)酵提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料：麥麩、黃豆粉、馬鈴薯、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、棉籽殼、麥麩、木屑、玉米粉、石灰；裂褶菌母種由云南菌視界生物科技有限公司保存。

主要儀器設(shè)備：發(fā)酵罐、pH計(jì)、搖床、滅菌鍋、烘箱、游標(biāo)卡尺、電子天平、錐形瓶等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 裂褶菌種子液培養(yǎng)條件優(yōu)化

1） 培養(yǎng)基篩選

種子液是液體菌種制備的關(guān)鍵，其菌絲活性及菌絲量直接關(guān)系到液體菌種質(zhì)量。從前期不斷試驗(yàn)得到的以下4個(gè)配方中篩選出適合裂褶菌菌絲生長的種子液，培養(yǎng)溫度23℃，培養(yǎng)時(shí)間為4 d，接種時(shí)接種塊大小統(tǒng)一為直徑3.8 mm，接種量為10個(gè)。

馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯 3%、葡萄糖 1.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.15%；麥麩培養(yǎng)基：麥麩3%、葡萄糖 1.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.15%；玉米粉培養(yǎng)基：玉米粉 3%、葡萄糖1.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.15%；黃豆粉培養(yǎng)基：黃豆粉3%、葡萄糖 1.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.15%。

干重測定：將培養(yǎng)好的液體菌液300 mL過濾，清水沖洗菌絲球，在烘箱中80℃烘干至恒重，精確稱量，每個(gè)處理3次重復(fù)，計(jì)算菌絲干重的平均值。

菌球直徑測定：每一種培養(yǎng)液中選取15個(gè)菌球排成一長列，測量總長度，計(jì)算平均值。

菌落數(shù)測定：移液槍吸取液體菌種1 mL，加入9 mL無菌水稀釋，再取1 mL稀釋的液體菌種涂布在PDA培養(yǎng)基上，25℃條件培養(yǎng)，記錄萌發(fā)時(shí)間及培養(yǎng)36 h的菌落萌發(fā)數(shù)。

2） 培養(yǎng)條件優(yōu)化

結(jié)合種子液培養(yǎng)基篩選情況，選擇一種培養(yǎng)基作為基準(zhǔn)培養(yǎng)基，單因素篩選 pH （4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、溫度 （20℃、22℃、24℃、26℃、28℃）、轉(zhuǎn)速 （110 r·min-1、130 r·min-1、150 r·min-1、170 r·min-1、190 r·min-1）以及通氣量（搖瓶使用1層、2層及不透氣封口膜封口），測定指標(biāo)同 1）。

1.2.2 深層發(fā)酵優(yōu)化

發(fā)酵罐培養(yǎng)目的是菌絲擴(kuò)大培養(yǎng)，滿足生產(chǎn)需要。以種子液最佳培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件參照1.2.1中培養(yǎng)條件優(yōu)化。

以發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積的2%、3%、4%、5%提前制備種子液，接種后，每天測量發(fā)酵液的pH，以推測菌絲生長過程中分泌酸性物質(zhì)的情況，指標(biāo)測定同1.2.1中培養(yǎng)基篩選外，還需測定液體菌種在培養(yǎng)料中的生長情況，包括生長勢及生長速度。指標(biāo)測定時(shí)間為接種后的第3天、第4天，旨在得到適合的種子液接入量以及培養(yǎng)時(shí)間。

根據(jù)1.2.1試驗(yàn)得到的結(jié)果，在發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵罐內(nèi)蒸汽壓力達(dá)到121℃、0.105 MPa，保持時(shí)間30 min～40 min，以達(dá)到徹底滅菌的效果。培養(yǎng)條件，冷卻至室溫接種，并調(diào)節(jié)罐壓保持在0.02 MPa～0.04 MPa，通氣量在 1 ∶（0.5～1.2）（料液體積 ∶空氣體積）。記錄數(shù)據(jù)，測定指標(biāo)。

1.2.3 出菇驗(yàn)證

根據(jù)本試驗(yàn)中優(yōu)化的培養(yǎng)條件培養(yǎng)的液體菌種，按照一定接種量接種到栽培袋（15 cm×55 cm）中，記錄吃料情況、子實(shí)體個(gè)數(shù)、出菇周期、出菇整齊度、生物學(xué)效率及鮮菇農(nóng)藝性狀等指標(biāo)，以評(píng)價(jià)液體菌種質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子液最優(yōu)培養(yǎng)基

在4種種子液培養(yǎng)基中，其菌絲干重、萌發(fā)情況、菌絲球直徑均有所差異，詳見表1。

表1 菌絲在不同配方中的生長情況Tab.1 Growth of mycelium in different formula

從表1可以看出，馬鈴薯、麥麩、玉米粉及黃豆粉均能為裂褶菌菌絲生長提供一定的營養(yǎng)，相對于常見的以馬鈴薯汁液為主要培養(yǎng)基添加物外，使用麥麩、玉米粉、黃豆粉更為簡便，用時(shí)較短，利用這些汁液作為培養(yǎng)基添加物是較好的選擇。根據(jù)液體菌種指標(biāo)檢測結(jié)果可以看出，菌絲在配方2中生長相對較好，其干重達(dá)0.17 g·300-1mL-1，且菌絲活力好，萌發(fā)快，在PDA培養(yǎng)基中僅18 h即可萌發(fā)，菌絲球直徑相對適中，不會(huì)造成管道堵塞。此外，由于裂褶菌菌絲發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生一定量的酸，而黃豆粉遇酸會(huì)凝結(jié)成豆腐塊，不適宜作為培養(yǎng)裂褶菌的液體培養(yǎng)基添加物。

在發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液氣味各異，在配方1和配方2中，酸味較配方3和配方4輕，可能與菌絲在不同配方中產(chǎn)酸能力有關(guān)，總體來說，發(fā)酵液酸味小的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲優(yōu)于酸味大的培養(yǎng)基。綜上，適宜裂褶菌菌絲生長的液體培養(yǎng)基為配方2。

2.2 種子液培養(yǎng)條件

2.2.1 pH

不同pH對種子液的影響情況見表2。

表2 不同pH對種子液的影響Tab.2 Effect of different pH values on spawn liquid

從表2可知，總體看弱酸條件更適宜裂褶菌菌絲生長，pH在5.0～6.5，菌絲干重、活力均優(yōu)于強(qiáng)酸及弱堿條件培養(yǎng)的菌絲。隨著pH逐漸增大，菌絲干重變化明顯，呈現(xiàn)出“少-多-少”的規(guī)律，在pH 4.70 時(shí)，干重僅 0.053 g·300-1mL-1，此時(shí)的菌絲活力較弱，萌發(fā)時(shí)間不低于24 h，菌落數(shù)僅5個(gè)；pH達(dá)到 5.50 時(shí)，菌絲干重也到達(dá)最大 0.270 g·300-1mL-1，菌絲活力旺盛，萌發(fā)時(shí)間僅為18 h，生長勢好。其后，菌絲干重逐漸下降，到pH 7.50時(shí)，菌絲干重低于 0.073 g·300-1mL-1，菌絲量極少。

在菌絲發(fā)酵過程中，液體氣味跟pH有關(guān)，pH越小，發(fā)酵液酸味越小，反之越大，指標(biāo)測定結(jié)果表明，裂褶菌菌絲在偏弱酸性培養(yǎng)基中生長勢好，活力強(qiáng)。在弱堿性環(huán)境中菌絲活性降低，生長勢差，實(shí)際生產(chǎn)過程中，可根據(jù)發(fā)酵液酸味輕重程度作為裂褶菌菌絲生長情況的一個(gè)重要指標(biāo)。

2.2.2 通氣

為驗(yàn)證通氣量對種子液培養(yǎng)的影響，設(shè)計(jì)了3個(gè)不同的處理，結(jié)果見表3。

表3 通氣對種子液的影響Tab.3 Effect of ventilation on spawn liquid

由表3可知，1層封口膜培養(yǎng)的菌絲干重比2層封口膜和不透氣封口膜培養(yǎng)的菌絲干重多出0.019 g·300-1mL-1、0.023 g·300-1mL-1，且菌絲活力好，萌發(fā)時(shí)間均為18 h，菌落數(shù)差異不大。此外，3個(gè)處理的pH均有所下降，但變化幅度小。綜上，培養(yǎng)4 d的種子液對于通氣量需求不大，因此，在制備種子液時(shí)通氣無需特別處理。

2.2.3 溫度

不同溫度對種子液的影響情況見表4。

表4 溫度對種子液的影響Tab.4 Effect of temperature on spawn liquid

由表4可知，總體來看，隨著溫度升高，菌絲干重及菌落數(shù)均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，而pH保持逐漸降低趨勢。在溫度為20℃、22℃時(shí)，菌絲量極少，菌絲干重量分別為 0.097 g·300-1mL-1、0.153 g·300-1mL-1，分別不到 26℃時(shí)菌絲干重的 1/3、1/2，菌落數(shù)相對較少。溫度升高到24℃時(shí)，菌絲干重為0.247 g·300-1mL-1，此時(shí)的菌絲萌發(fā)情況較好，菌落數(shù)最多，表明此時(shí)的菌絲活性強(qiáng)，隨著溫度繼續(xù)增加至26℃和28℃時(shí)，菌絲干重達(dá)到最大為0.35 g·300-1mL-1并保持恒定，但菌落數(shù)逐漸減少，這與溫度高、菌絲老化嚴(yán)重有關(guān)。因此，適合裂褶菌種子液培養(yǎng)的最適溫度為24℃～26℃。

2.2.4 轉(zhuǎn)速

不同轉(zhuǎn)速對種子液的影響情況見表5。

表5 轉(zhuǎn)速對種子液的影響Tab.5 Effect of rotation speed on spawn liquid

由表5可知，隨著轉(zhuǎn)速增加，菌絲干重及菌落數(shù)先增加后減少，在轉(zhuǎn)速為150 r·min-1時(shí)，菌絲球直徑大，菌絲干重相對最重，菌絲活力強(qiáng)，萌發(fā)快，菌落數(shù)最多，且菌絲形態(tài)多呈鵝毛狀，菌絲球占少部分，發(fā)酵液中菌絲均勻；而轉(zhuǎn)速在110 r·min-1時(shí)，恰好相反。當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到 170 r·min-1、190 r·min-1時(shí)，菌絲球直徑大，在搖瓶中菌絲數(shù)量少，不宜作為種子液。作為種子液來源，選擇菌絲數(shù)量多的接入發(fā)酵罐更容易增加萌發(fā)點(diǎn)，且培養(yǎng)的菌絲球相對均勻。綜上，適合裂褶菌種子液培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150 r·min-1。

2.3 菌絲擴(kuò)大培養(yǎng)

2.3.1 發(fā)酵罐接種量

在篩選出種子液配方后，按照上述條件進(jìn)行種子液的制備，參照上述培養(yǎng)條件，使用發(fā)酵罐對菌絲進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并且對種子液接種量進(jìn)行了試驗(yàn)，以保證菌絲活力旺盛同時(shí)縮短培養(yǎng)周期。根據(jù)食用菌液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)（DB21/T 1693-2008）中規(guī)定的食用菌液體菌種量（濕重＞8 g·100-1mL-1），即可作為生產(chǎn)菌種。試驗(yàn)驗(yàn)證，35 g濕重可烘干得到1 g干重。根據(jù)實(shí)際情況，菌絲球直徑大小無具體標(biāo)準(zhǔn)，在菌絲球均勻、濃度正常、活力好的情況下，保證菌絲球不會(huì)造成管道堵塞均可。

從接種量來看，當(dāng)接種量為2%、3%、4%、5%時(shí)，培養(yǎng)3 d和4 d的菌絲，平均干重分別是0.578 g·300-1mL-1、1.137 g·300-1mL-1、1.488 g·300-1mL-1、1.428 g·300-1mL-1，具體見圖 1。

圖1 菌絲干重情況Fig.1 The dry weight of mycelial

由圖1可知，接種量為2%時(shí)，菌絲量少（濕重＜8 g·100-1mL-1）；接種量增至3%時(shí)，菌絲量增加了近2倍；隨后，接種量增加，菌絲量變化幅度??；4%接種量時(shí)，菌絲量達(dá)到最大，隨后呈現(xiàn)下降趨勢。從培養(yǎng)天數(shù)來看，培養(yǎng)時(shí)間越長，菌絲量越大。菌絲生長速率情況見圖2。

圖2 菌絲生長速度情況Fig.2 The growth rate of mycelial

由圖2可知，液體菌種接入培養(yǎng)料中的生長速度與培養(yǎng)天數(shù)、接種量均有關(guān)。在菌絲培養(yǎng)3 d時(shí)，隨接種量增大，菌絲生長速度先增大，后逐漸降低，在接種量3%時(shí)達(dá)到最大，為0.761 cm·d-1。在菌絲培養(yǎng)4 d時(shí)，隨接種量增大，菌絲生長速度也呈現(xiàn)出相同規(guī)律，在接種量4%時(shí)達(dá)到最大，為0.741 cm·d-1，但仍小于培養(yǎng)3 d時(shí)的最大生長速度。菌絲萌發(fā)情況見圖3。

圖3 菌絲萌發(fā)情況Fig.3 Mycelial germination situation

計(jì)算菌落萌發(fā)時(shí)間均為涂平板后的第24小時(shí)，由圖3可以看出，對接種量而言，接種量增大，菌落數(shù)呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢。在接種量4%時(shí)，菌落數(shù)最多，表明此時(shí)的菌絲活力好，相同時(shí)間條件下菌落萌發(fā)數(shù)多。接種量2%、3%時(shí)，由于菌絲量較少，菌落萌發(fā)數(shù)少于接種量4%時(shí)，但在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)超過48 h后，菌落數(shù)均呈指數(shù)級(jí)上升；在接種量5%時(shí)，菌絲量多，可能由于菌絲活性下降，多數(shù)菌絲萌發(fā)時(shí)間稍有滯后，只有部分菌絲萌發(fā)。從培養(yǎng)時(shí)間來看，培養(yǎng)時(shí)間越長，菌落數(shù)增多，但相差不明顯。綜上，4%的接種量培養(yǎng)3 d或者4 d對于菌絲生長最合適。菌絲擴(kuò)大培養(yǎng)情況見表6。

表6 菌絲擴(kuò)大培養(yǎng)情況Tab.6 Mycelial expansion cultivation situation

由表6可知，接種量、培養(yǎng)天數(shù)不同，菌絲球直徑及菌絲形態(tài)有所差異，菌絲球直徑隨接種量、培養(yǎng)天數(shù)增加而增多，且鵝毛狀菌絲與菌絲球比例也相對增多。但在接種量為5%、培養(yǎng)天數(shù)為4 d時(shí)，菌絲球直徑達(dá)7.03 mm，使用時(shí)會(huì)造成管道堵塞且菌絲老化明顯。因此，接大接種量、延長培養(yǎng)時(shí)間并不是最好的處理。

綜上，發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)裂褶菌菌絲的條件可設(shè)定為溫度24℃、接種量為3%或4%、培養(yǎng)3 d，按照此培養(yǎng)方法得到的液體菌種濕重分別為12.1 g·100-1mL-1、14.5 g·100-1mL-1，且活力好，菌絲球及菌絲大小均勻、生長速度快，可用于生產(chǎn)。

2.3.2 發(fā)酵終止pH變化趨勢分析

從種子液試驗(yàn)結(jié)果來看，發(fā)酵終止pH呈弱酸性時(shí)菌絲生長好，為進(jìn)一步了解pH與發(fā)酵過程中菌絲生長情況之間的聯(lián)系，對發(fā)酵液的pH進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖4。

圖4 pH變化趨勢Fig.4 pH change trend

由圖4可知，在接種前培養(yǎng)基自然pH均維持在6.2～6.3，接種前2 d的pH變化趨勢不大，但接種量為5%時(shí)，培養(yǎng)第2天的pH呈直線下降。在培養(yǎng)3 d時(shí)，pH相差較大，這與菌絲量多少有關(guān)，此時(shí)5%接種量對應(yīng)的pH已低于5.0，而2%接種量對應(yīng)的pH仍維持在6.0以上。由 2.3.1分析結(jié)果來看，此階段不建議使用2%的液體菌種，而3%、4%接種量對應(yīng)的pH均在5.5左右，這與種子液結(jié)果中表明的pH為5.5時(shí)，菌絲生長良好相一致，是合格的液體菌種。在培養(yǎng)4 d時(shí)，4個(gè)處理的pH接近，均在5.0～5.5，結(jié)合表6中的結(jié)果，此時(shí)的菌絲量較大，2%接種量的菌絲量與第3天相比高5倍。因此，培養(yǎng)條件相同，無論接種量多少，pH維持在5.0～5.5，表明菌絲量已達(dá)到濕重＞8 g·100-1mL-1，可用于生產(chǎn)。

綜上，裂褶菌液體菌種培養(yǎng)過程中可以通過pH來監(jiān)測液體菌種生長情況。結(jié)合以上試驗(yàn)結(jié)果，以配方2為液體培養(yǎng)基，在溫度24℃、培養(yǎng)基初始pH自然或者調(diào)節(jié)到6.0，在pH為5.5左右時(shí)完成培養(yǎng)，此方法簡單，操作便捷。

2.4 液體菌種出菇情況

依據(jù)上述試驗(yàn)參數(shù)培養(yǎng)的液體菌種用于栽培出菇，菌種接入到培養(yǎng)料中，僅18 h就萌發(fā)，時(shí)間短，且菌絲生長旺盛，生長勢好，養(yǎng)菌時(shí)間為9 d即可誘導(dǎo)出菇。由于工廠化栽培成本高，本次試驗(yàn)選擇粗放的管理?xiàng)l件。在此情況下仍出菇整齊，朵型（菊花型）與工廠化栽培的一致，顏色灰白，從接種到采收整個(gè)周期為23 d～25 d，采收子實(shí)體60個(gè)，生物學(xué)效率達(dá)14.7%。出菇情況如圖5所示。

圖5 出菇情況Fig.5 Mushroom production

圖5試驗(yàn)結(jié)果表明，液體菌種生長快，萌發(fā)點(diǎn)多，出菇時(shí)間比使用傳統(tǒng)的固體菌種縮短1 d～2 d；簡易廠房栽培裂褶菌，其產(chǎn)量雖不及工廠化栽培，但仍可行，一潮菇生物學(xué)效率達(dá)14.7%，已高于傳統(tǒng)栽培產(chǎn)量；除菇峰整齊度及出菇周期（長）不及工廠化栽培外，其余農(nóng)藝性狀差異不大。

綜上，本試驗(yàn)培養(yǎng)的液體菌種用于生產(chǎn)是可行的。隨后，繼續(xù)將液體菌種應(yīng)用到工廠化栽培中，以完善裂褶菌工廠化栽培工藝。

3 結(jié)論

近年來，液體菌種已成為重點(diǎn)研究對象，目前國內(nèi)成熟的工廠化栽培品種，如杏鮑菇、海鮮菇、金針菇等，液體菌種的研究相對透徹，推進(jìn)了食用菌工廠化栽培進(jìn)程。液體菌種相對于固體菌種而言，有培養(yǎng)周期短、菌齡一致、萌發(fā)快、接種速度快等優(yōu)點(diǎn)，是食用菌栽培、優(yōu)選、必選模式[5]。

裂褶菌栽培起步較晚，在2012年時(shí)才有商業(yè)化栽培的報(bào)導(dǎo)，且栽培效果并不理想。在2017年時(shí)才進(jìn)行工廠化初探，并取得一定成果[6]。在這之前，有學(xué)者對裂褶菌液體菌種進(jìn)行研究，但研究多集中于多糖提取，很少或幾乎未應(yīng)用到栽培中，因此，使用液體菌種進(jìn)行裂褶菌人工栽培這一領(lǐng)域的研究是脫節(jié)的。本試驗(yàn)在之前的液體菌種研究基礎(chǔ)上創(chuàng)新性地用麥麩代替了馬鈴薯作為液體培養(yǎng)基添加物，減少成本的同時(shí)操作更方便，培養(yǎng)的菌絲活力好、長勢好；發(fā)酵液的pH可作為初步判斷液體菌種是否達(dá)到培養(yǎng)完成度的重要指標(biāo)，此方法簡捷，易檢測；本研究獲得了裂褶菌液體菌種培養(yǎng)的基本工藝條件，將此條件下培養(yǎng)的液體菌種用于出菇驗(yàn)證，縮短了養(yǎng)菌時(shí)間，且出菇效果要優(yōu)于傳統(tǒng)使用固體菌種，因此可以認(rèn)為使用液體菌種進(jìn)行栽培是可行的。后續(xù)將裂褶菌液體種投入到工廠化生產(chǎn)中，形成一套標(biāo)準(zhǔn)的、成熟的工藝，是亟需研究的課題。