腎康注射液指紋圖譜的研究

孫小萌,筆雪艷，曲范娜，張清波，楊會兵，張 雪，周 楠

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040；2.黑龍江省食品藥品檢驗檢測所，黑龍江 哈爾濱150088；3.黑龍江省食品藥品監(jiān)督管理局，黑龍江 哈爾濱150001；4.西安世紀(jì)盛康藥業(yè)有限公司，陜西 西安710300)

腎康注射液由大黃、丹參、黃芪和紅花四味藥材組成，是由西安世紀(jì)盛康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。具有益氣活血，降逆泄?jié)幔ǜ麧竦墓π1-2]。臨床上主要用于治療慢性腎衰竭，肺部感染，慢性阻塞性肺疾病急性加重，心力衰竭，惡性腫瘤，糖尿病，高尿酸血癥等[3-4]。原標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(試行)YBZ08522004，采用高效液相色譜方法，對四味藥材分別建立了指紋圖譜；但該標(biāo)準(zhǔn)檢測耗時長，不便于日常大批量腎康注射液的質(zhì)量檢測，同時亦消耗較多的有機試劑，不利于節(jié)能環(huán)保。之后企業(yè)在進一步的修訂過程中，雖然將四味藥材合成一張指紋圖譜，但依然采用了高效液相色譜法，所獲得的圖譜中化學(xué)成分信息量較小。而且現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)未考察不同品牌液相色譜儀及色譜柱等對指紋圖譜采集的影響，為該標(biāo)準(zhǔn)的提升及大批量的藥品檢驗工作開展帶來不便。基于指紋圖譜信息量最大化，多品牌液相儀器均可重現(xiàn)實驗結(jié)果的考慮，此次研究采用了超高效液相色譜方法，結(jié)合質(zhì)譜定性鑒定了90%以上的色譜峰結(jié)構(gòu)與歸屬；并采用了3個不同品牌的超高效液相色譜儀對所建立的指紋圖譜進行驗證，得到了較為滿意的結(jié)果。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters超高效液相色譜儀，配有四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器；ACQUITY UPLC?CSH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)；Waters Acquity I class UPLC G2-XS Q Tof四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀；XS205DU電子天平。

1.2 試劑

甲醇(色譜純、Dikma 公司)；甲酸(質(zhì)譜級)；純化水(實驗室自制)。

1.3 對照品

毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號：111920-201304)、原兒茶醛(批號：110810-201007)均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.4 樣品

腎康注射液(批號：201211041、201306027、201307011、201312011、201402012、201403023、201404031、201405021、20141104、201505023、201501011、201502013、201503021、201504011、201510021、201507021、201508023、201509041、201510053、201511021)，共20批，均由西安世紀(jì)盛康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以ACQUITY UPLC?CSH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)，以甲醇(A)和0.1%甲酸(B)為流動相，梯度洗脫(0～3 min,1% A；3～15 min,1% A→4% A；15～55 min，4% A→40% A；55～65 min，40% A→60% A；65～66 min，60% A→90% A；66～69 min，90% A)；流速為0.4 ml/min，檢測波長為280 nm，進樣量2 μl,柱溫30 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件

采用ESI離子源，負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓設(shè)定為2.50 V，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，錐孔電壓40 V；質(zhì)譜方法：全信息串聯(lián)質(zhì)譜(MSE)；質(zhì)量數(shù)50～1 200 Da；碰撞能量20～40 V。

2.3 對照品與供試品溶液的制備

對照品溶液的制備：精密稱取原兒茶醛對照品和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，分別加甲醇制成濃度均為10 μg/ml的對照品溶液。

供試品溶液的制備：取腎康注射液適量，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1精密度試驗

取批號為201403023樣品，按照“2.3”項下處理樣品，按照“2.1”項下條件進樣測定，連續(xù)進樣5次，考察指紋圖譜精密度。將精密度實驗色譜圖導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.130723版)》，計算相似度，其平均值為0.965，RSD為0.06%，表明儀器精密度較高。

2.4.2重復(fù)性試驗

取同一批號的腎康注射液(批號：201403023)，供試品溶液的制備按“2.3”項下處理，平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下條件進樣測定，考察指紋圖譜的變化情況。將重復(fù)性實驗色譜圖導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.130723版)》，計算相似度，其平均值0.965，RSD為0.08%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗

按照“2.3”項下方法制備腎康注射液(批號：201403023)供試品溶液一份，于常溫下保存，按“2.1”項下條件進樣測定，分別在0、6、12、20、24 h測定供試品溶液，考察穩(wěn)定性，將穩(wěn)定性實驗色譜圖導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.130723版)》，計算相似度，其平均值是0.965，RSD值為0.06%，說明腎康注射液供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)果

3.1 腎康注射液UPLC指紋圖譜

取20批不同批次的腎康注射液樣品，按照“2.3”項下處理對照品及供試品，按照“2.1”、“2.2”項下條件測定樣品的指紋圖譜，數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)研究(2012.130723版)》，以所確定的16個共有峰進行校正處理，生成腎康注射液指紋圖譜與對照品對比圖(圖1)、腎康注射液對照指紋圖譜(圖2)、不同批次的疊加指紋圖譜(圖3)。

取20批不同批次的腎康注射液按上述“2.1”、“2.2”、“2.3”項下測定樣品的指紋圖譜，將所得的樣品指紋圖譜與上述所得的對照指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)研究(2012.130723版)》各自進行全圖匹配，16點校正，計算各批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度，結(jié)果20批注射液相似度均大于0.90，20批樣品相似度的RSD為1.79%。表明不同批次腎康注射液相似度較高，指紋圖譜相似性良好說明工藝穩(wěn)定。

3.2 腎康注射液特征峰指認(rèn)

質(zhì)譜采用負(fù)離子模式，方法是MSE，對腎康注射液UPLC指紋圖譜標(biāo)示的主要色譜峰進行質(zhì)譜確認(rèn)，根據(jù)主要成分的色譜行為，結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合文獻(xiàn)[5-8]及對照品，推測了腎康注射液UPLC指紋圖譜的26個主要色譜峰。結(jié)果見圖4和表1。

圖1 腎康注射液指紋圖譜與對照品色譜圖比較 A.對照品色譜圖；B.對照品色譜圖；C.腎康注射液指紋圖譜；1.原兒茶醛；2.毛蕊異黃酮葡萄糖苷

圖2 腎康注射液對照指紋圖譜

圖3 6批腎康注射液UPLC指紋圖譜疊加圖

圖4 腎康注射液的質(zhì)譜圖

4 討論

4.1 藥材與腎康注射液指紋圖譜中特征峰的歸屬研究

供試品溶液的色譜圖與對照指紋圖譜(見圖2)基本一致，主要的色譜峰應(yīng)在65 min以內(nèi)出完，且分離良好。供試品腎康注射液指紋圖譜共有16個特征峰，依次對應(yīng)表1中序號1～16的成分。其中2號峰和10號峰由對照品定位，分別依次是原兒茶醛、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(見圖1)。由圖5～8可知，大黃藥材與供試品指紋圖譜中特征峰共有的是5、6、7、9、10、11、12、14、15、16號峰，共計歸屬10個峰(見圖5)。黃芪藥材與供試品指紋圖譜中特征峰共有的是10號峰，共計歸屬1個峰(見圖6)。紅花藥材與供試品指紋圖譜中特征峰共有的是3、8、9、13號峰，共計歸屬4個峰(見圖7)。丹參藥材與供試品指紋圖譜中特征峰共有的是1、2、14號峰，共計歸屬3個峰(見圖8)。10號峰毛蕊異黃酮葡萄糖苷是大黃、黃芪藥材所共有的；9號峰是大黃、紅花藥材所共有的；14號峰為丹參與大黃藥材所共有；4號峰是四味藥材制成注射液后新生成的色譜峰。

4.2 中間體與腎康注射液成品的主成分歸屬

中間體A是由丹參黃芪生成，采用“2.1”、“2.2”項下條件分析，結(jié)果見圖9和表1，結(jié)合質(zhì)譜鑒定出中間體A中13個成分，與腎康注射液已鑒定的26個成分進行歸屬(見圖4和表1)，發(fā)現(xiàn)中間體A中的全部成分均能歸屬在樣品腎康注射液中。

中間體B由紅花，大黃組成，采用“2.1”、“2.2”項下條件分析，結(jié)果見圖10和表1，推測了其中9個成分。與腎康注射液已鑒定的26個成分進行歸屬(見圖4和表1)，共有成分有5個，分別是對應(yīng)表1中序號為4、6、14、15、16號。

中間體A和中間體B共有的成分有2個，分別對應(yīng)表1中序號為14、16號成分。二者與成品成分進行歸屬，合計歸屬了16個色譜峰，分別對應(yīng)表1中序號是1、2、4、6、14、15、16、17、19、20、21、22、23號。

中間體B 在制成成品的過程中丟失了4個成分，分別是沒食子酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、奧刀拉亭-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷。腎康注射液中的成分經(jīng)中間體A、B歸屬后，未歸屬的成分有10個，分別對應(yīng)表1中序號是3、5、7、8、9、10、11、12、13、18號。

4.3 不同色譜柱的考察

確定指紋圖譜的色譜條件后，為考察不同色譜柱對指紋圖譜重現(xiàn)性的影響，對3種不同品牌的色譜柱進行考察。3種色譜柱的信息見表2。根據(jù)色譜峰的峰形、分離度效果進行選擇。實驗結(jié)果表明，不同色譜柱分離效果相差較大，色譜峰峰形和分離效果較好的是ACQUITY UPLC?CSH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。提示建立本指紋圖譜需要固定色譜柱型號，因此，建議選用該型號色譜柱。

表2 三種色譜柱的信息

4.4 不同品牌UPLC色譜儀的考察

應(yīng)用同一種型號色譜柱ACQUITY UPLC CSH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，在相同的色譜條件下，隨機選取一批腎康注射液(批號：201507021)，分別在沃特世(Waters)、賽默飛世爾(Thermofisher)和安捷倫(Agilent)三個品牌的超高效液相色譜儀上進行檢測，同一批次樣品在不同儀器上所得圖譜相似度分別為：Waters：0.901；Thermofisher：0.903；Agilent：0.900，表明重現(xiàn)性良好，不同品牌儀器得到的色譜圖相似度結(jié)果差別不大。

4.5 對照品的選擇

大黃、丹參、紅花和黃芪都是常用的中藥材，所含成分的含量測定與藥理實驗均有較多的報導(dǎo)。根據(jù)上述優(yōu)化后的色譜條件，對四味藥材中常用于測定含量并具有藥理活性的對照品進行檢測(見表3)，結(jié)果表明，原兒茶醛對照品與毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品可以做為色譜峰定位的參考(見圖1)。由于實驗條件有限，后期會收集更多的對照品進行研究。

表3 對照品的選擇

4.6 小結(jié)

中藥指紋圖譜具有整體性和模糊性的基本屬性，能夠較全面的反應(yīng)中藥材中所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量，能更加客觀的從整體上評價中藥的內(nèi)在質(zhì)量。相較單一成分或指標(biāo)性成分評價中藥的質(zhì)量更加科學(xué)全面。本文主要對不同批次腎康注射液成品展開研究，經(jīng)相似度計算，表明各批次間相似度相差不大，質(zhì)量穩(wěn)定。下一步將收集更多的樣品，并進行中間體的研究，控制生產(chǎn)工藝對質(zhì)量的影響，為腎康注射液質(zhì)量控制提供更多的理論支持。

利用UPLC法建立的腎康注射液指紋圖譜方法，經(jīng)方法學(xué)驗證具有良好的精密度，重復(fù)性和穩(wěn)定性。文中利用UPLC-MS技術(shù)，建立腎康注射液四味藥材的指紋圖譜，其靈敏度高，穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，給出的信息更加全面。指紋圖譜鑒定歸屬26個色譜峰，進一步闡明腎康注射液的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為腎康注射液的質(zhì)量控制提供了新依據(jù)。