基于UPLC-Q-TOF-MS技術鑒定防風在大鼠體內的入血成分及代謝產物

李悅悅，章 斌，原永芳

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院藥劑科，上海 200011)

防風為傘形科植物防風Saposhnikoviadivaricate(Turcz.) Schischk.的未抽花莖植株的干燥根。味辛甘，性溫，能解表祛風、勝濕、止痙。用于感冒頭痛、風濕痹痛、風疹瘙癢和破傷風。藥理實驗研究表明，其具有解熱、鎮痛、鎮靜、抗炎、抗過敏、抗驚厥等作用[1-4]。其主要成分包括揮發油、色原酮類、有機酸、香豆素類、聚炔類、多糖類等化合物[5-8]，但其藥效物質基礎尚不明確，本課題組前期研究[9]運用HPLC-TOF-MS技術研究了防風入血原型成分，但未尋找血液中防風代謝產物，且僅對化合物進行了初步推斷。本實驗首次采用超高效液相色譜串聯飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF-MS)技術鑒定大鼠血漿中防風的入血成分及代謝產物，共鑒定了大鼠血漿中21個來源于防風的化合物，包括10個入血原型成分和11個代謝產物，并推測其入血成分的代謝途徑，為進一步研究防風的藥效物質基礎及作用機制提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1290 Infinity液相色譜系統、Agilent6530 Accurate-Mass Q-TOF-MS串聯四極桿-飛行時間質譜儀，配有電噴霧離子源(美國安捷倫公司)；Masshunter Qualitative Analysis質譜分析軟件，高速低溫離心機(美國Therma公司)。

1.2 材料

防風藥材產自內蒙古，購自上海德康大藥房，并由第二軍醫大學藥學院生藥學教研室孫連娜副教授鑒定為傘形科植物防風Saposhnikoviadivaricate(Turcz.) Schischk.的干燥根。分析用水均使用超純水，甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，其余試劑為分析純。所有的溶劑和樣品在進入高效液相色譜之前均經過0.22 μm纖維濾膜濾過。

雄性Wistar大鼠，體質量(180±20)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號SCXK(滬)2007-0005。采用代謝籠法(每籠1只)飼養于第二軍醫大學藥學院動物房，室溫22℃，濕度72%，12 h晝夜交替，自由采食、飲水。實驗前禁食 12 h。

2 方法

2.1 防風水煎液的制備

稱取防風飲片500g，粉粹后于5 L水(10倍水量)中浸泡1 h，煮沸后煎煮1 h，趁熱濾過，藥渣再加水煎煮1 h后濾過，合并2次濾液，濃縮至1.4g/ml,為灌胃給藥用防風水煎液。將其稀釋200倍，0.22μm 微孔濾膜濾過，按“2.4”項下色譜條件測定。

2.2 動物給藥與血漿樣品采集

4只雄性Wistar大鼠，給藥前禁食12 h，自由飲水。實驗前先經眼眶靜脈取血0.2 ml(空白對照)，然后以21g/kg劑量防風水煎液給大鼠灌胃，參照防風色原酮類成分的藥動學特征[10]分別于給藥后10、30、60、120、240 min，從大鼠眼眶取血0.2 ml，2800×g離心10 min后，分離血漿，置-80℃冰箱保存。

2.3 血漿樣品處理

加300μl乙腈至100μl血樣中，渦旋3 min，于10400×g高速離心5 min，取上清，等量混合不同時間點血樣上清，氮氣吹干(35℃)，然后復溶于100 μl甲醇，10400×g高速離心3 min，取上清3 μl進樣分析。

2.4 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm，Agilent)；柱溫25 ℃，流速0.3 ml/min，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～5 min，5%～30% B；5～10 min，30%～40% B；10～16 min，40%～95% B；16～18 min，95% B；進樣量3 μl。

質譜條件：采用正、負離子模式進行檢測，檢測參數：毛細管電壓正、負離子模式下分別為4 000 V和3 500 V、干燥氣流速11 L/min、干燥氣溫度350 ℃、噴霧氣壓45 psig、碎裂電壓120 V、Skimmer電壓60 V、數據采集范圍m/z100～1100，選取m/z121.0509和m/z922.0098的內標離子作實時質量數校正。進一步對防風入血成分和代謝產物離子進行MS/MS分析，碰撞能量根據分子量調節。

3 結果與分析

運用UPLC-Q-TOF-MS技術，通過比較防風水煎液、空白血漿和大鼠灌胃防風水煎液后的血漿圖譜，獲得入血原型成分及代謝物。對于有對照品的化合物，通過與對照品比對保留時間、特征碎片離子來確定其結構及分子式，對于無對照品的化合物，根據文獻及碎片離子信息來確定其結構及分子式。最終在大鼠血漿樣品中分析鑒定出10個入血原型成分和11個代謝產物，具體見表1所示；正離子模式下總離子流圖(TIC)見圖1所示。

3.1 入血原型成分的鑒定

圖1的離子峰1、5、7、13、14、17、18、19、20和 21與相應對照品及防風水煎液譜圖的保留時間比較，并比對相應碎片離子信息，分別鑒定為防風的原型成分腺苷、divaricatacid、升麻苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、去甲升麻素、(3S)-2,2-二甲基-3,5-二羥基-8-羥甲基-3,4-二氫-2H,6H-苯并[1,2-b:5,4-b’]雙吡喃-6-酮、5-O-甲基維斯阿米醇、亥茅酚苷和紫花前胡苷元；峰7的保留時間(tR=4.998 min)與升麻苷對照品的保留時間(tR=5.024 min)相近，其準分子離子峰為[M+H]+m/z為469.1726，其碎片離子基峰為脫去一分子糖[M+H-C6H10O5]+的m/z為307，與升麻素[M+H]+的m/z一致，因此峰7鑒定為升麻苷。峰 13 的保留時間(tR=5.943 min)與升麻素對照品的保留時間(tR=5.952 min)相近，其[M+H]+的m/z為307.1171，碎片離子289、259、235、221、205和177與升麻素對照品碎片離子一致，參考文獻報道[8]，推測其裂解規律如圖3所示，峰 13鑒定為升麻素。峰14的保留時間(tR=6.025 min)與5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品的保留時間(tR=6.029 min)相近，其準分子離子峰[M+H]+的m/z為453.1740，其主要碎片離子為脫去一分子糖[M+H-C6H10O5]+后m/z為291，與5-O-甲基維斯阿米醇[M+H]+的m/z一致，其他碎片離子273，243，219，205，189與5-O-甲基維斯阿米醇一致，因此峰14鑒A.ESI+模式定為5-O-甲基維斯阿米醇苷。峰17、18為同分異構體，tR分別為7.290和7.725 min，[M+H]+的m/z為293.1025，均具有碎片離子275[M+H-H2O]+、221[M+H-C4H8O]+，與防風水煎液圖譜對比，結合化合物Clog P值，推斷峰17和18分別為去甲升麻素和(3S)-2,2-二甲基-3,5-二羥基-8-羥甲基-3,4-二氫-2H,6H-苯并[1,2-b:5,4-b’]雙吡喃-6-酮(Clog P值分別為0.9053和1.1753)。峰19的保留時間(tR=7.817 min)與5-O-甲基維斯阿米醇對照品的保留時間(tR=7.822 min)相近，其[M+H]+的m/z為291.1231，其碎片離子273[M+H-H2O]+、243[M+H-H2O-2CH3]+、219[M+H-C4H8O]+、205[M+H-H2O-2CH3-C3H2]+、189[M+H-H2O-2CH3-C3H2O]+和161[M+H-H2O-2CH3-C3H2O -CO]+與升麻素有相似的裂解規律，說明與其具有相同的呋喃色原酮母核結構，因此，鑒定其為5-O-甲基維斯阿米醇。峰5(tR=4.831 min)的[M+H]+的m/z為321.0974，其碎片離子303[M+H-H2O]+、273[M+H-H2O- 2CH3]+、249[M+H-C4H8O]+、235[M+H-H2O-2CH3-C3H2]+亦符合呋喃色原酮類化合物的裂解規律，因此，推斷其為divaricatacid。峰20的保留時間(tR=7.887 min)與亥茅酚苷對照品的保留時間(tR=7.892 min)相近，[M+H]+m/z為439.1606，其碎片離子277、259、205與亥茅酚苷對照品一致，因此鑒別峰20為亥茅酚苷。峰21(tR=7.961 min)的[M+H]+m/z為247.0963，其碎片離子229[M+H-H2O]+、187[M+H-H2O-C3H6]+，與文獻報道的紫花前胡苷元碎片離子相同，因而推斷其為防風的香豆素類成分紫花前胡苷元。

圖1 防風水煎液大鼠體內成分提取離子流圖下防風水煎液; B.ESI+模式下空白血漿; C.ESI+模式下給藥防風水煎液大鼠血漿； D.ESI-模式下空白血漿；E.ESI-模式下給藥防風水煎液大鼠血漿

表1 防風在大鼠體內的入血成分及代謝產物

圖2 正離子模式下升麻素質譜碎片信息

圖3 升麻素可能的質譜裂解途徑(┐H+ 表示[M+H]+)

圖4 升麻素的代謝途徑

3.2 代謝物的鑒定

防風的主要入血成分為色原酮類化合物，其代謝途徑主要包括氧化、還原、水解、葡萄糖醛酸化等。以升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇為例，說明其主要代謝物的鑒別和體內代謝途徑。

3.2.1升麻素的體內代謝物

峰2、3、4和9的分子式均為C16H18O7(相對分子質量322.1053，[M+H]+的m/z分別為323.1122、323.1127、323.1120和323.1133)，其tR依次為4.291、4.57、4.652和5.241 min。與升麻素(C16H18O6)相比，增加了16[M+O]+，根據精確相對分子質量及誤差，可以推測峰2、3、4和9均為升麻素的羥基化代謝物。峰2的產物離子305比升麻素的碎片離子289多16質量數[289+O]，而碎片離子m/z259、235和221和升麻素的碎片離子相同，說明其羥基在2’-或5’位。峰3與峰2的碎片離子相同，無法根據碎片離子區分峰3與峰2；通過Chemdraw軟件計算其Clog P值，峰2與峰3分別為-0.8591和-0.7565，由此推斷峰2與峰3分別為2’-羥基升麻素和5’-羥基升麻素。峰4的產物離子275比升麻素的碎片離子259多16質量數[259+O]，說明其羥基在3’-或8位。峰9具有與峰4相同的碎片離子247[M-H2O-2CH3-CO]、232[M-H2O-2CH3-CO-CH3]，結合Clog P值(3’-羥基升麻素和8-羥基升麻素分別為-0.3647和-0.0188)，推斷峰4和峰9分別為3’-羥基升麻素和8-羥基升麻素。峰8[M+H]+的m/z為483.1498，與升麻素相比，增加了176[M+C6H8O6]，且其碎片離子307、289、259和235與升麻素的分子離子峰及碎片離子相同，可以推測峰8為升麻素-O-葡萄糖醛酸苷。升麻素的代謝途徑見圖4所示。

3.2.25-O-甲基維斯阿米醇的體內代謝物

峰10、11、15和16的分子式均為C16H18O6(相對分子質量306.1103，[M+H]+的m/z分別為307.1183、307.1183、307.1184和307.1165)，其tR依次為5.547、5.772、6.23和6.745 min。與5-O-甲基維斯阿米醇(C16H18O5)相比，增加了16[M+O]+，根據精確相對分子質量及誤差，可以推測峰10、11、15和16均為5-O-甲基維斯阿米醇的羥基化代謝物。峰16具有碎片離子259[M-H2O-2CH3]和235[M-C4H8O]，比5-O-甲基維斯阿米醇碎片離子243、219分別增加了16[M+O]+，另有231[M-H2O-2CH3-CO]和216[M-H2O-2CH3-CO-CH3]，因而推斷峰16為8-羥基-5-O-甲基維斯阿米醇。峰15的產物離子包括259[M-H2O-2CH3]、231[M-H2O-2CH3-CO]和216[M-H2O-2CH3-CO-CH3]，推斷其為3’-羥基-5-O-甲基維斯阿米醇。峰10與峰11的碎片離子相似，包括289[M-H2O]、271[M-2H2O]、231[M-H2O-2CH3-CO]，通過Chemdraw軟件計算5-O-甲基維斯阿米醇的2-羥基、5-羥基、3-羥基和8-羥基代謝物的Clog P值分別為0.6779、0.7806、1.1723和1.5081，因而推斷峰10和峰11分別為2-羥-5-O-甲基維斯阿米醇和5-羥基-5-O-甲基維斯阿米醇。峰6在負離子模式下[M-H]-的m/z為275.0926，與5-O-甲基維斯阿米醇(C16H18O5)相比，減少了14[M-CH2]-，另有碎片離子260、245、217，推斷其為脫甲基-5-O-甲基維斯阿米醇。

4 討論

運用UPLC-Q-TOF-MS技術，可以從復雜的生物樣品中得到無干擾的代謝產物的質譜信息。本實驗采用該技術，通過與對照品、防風水煎液圖譜比對，分析代謝產物的碎片離子，鑒定了大鼠血漿中防風的入血成分和代謝產物；共檢測到10個入血原型成分和11個代謝產物。防風入血成分的主要代謝途徑包括羥化、去甲基和葡萄糖醛酸化。本研究為首次利用UPLC-Q-TOF-MS技術對防風體內成分進行研究，為防風藥效物質的尋找奠定了基礎。