基于微透析技術的苦參堿凝膠經皮給藥的藥動學研究

顧 清，周劍斌，徐劍良，朱國花，舒 薇

(上海市靜安區閘北中心醫院藥劑科,上海 200070)

苦參堿(matrine)為豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.、苦豆子S.alopecuroides.L、 廣豆根S.subprostrata chun et T.chen等中藥的活性成分，具有抗炎、抗過敏、鎮痛、抗心率失常、抗肝纖維化、抗腫瘤、抗病毒及免疫抑制等藥理活性[1-3]。苦參堿單用或與其他藥物配伍外敷，對于濕疹、神經性皮炎、銀屑病等疾病具有良好的治療效果[4]。

微透析(MD)是一種新的生物取樣技術[5]。在經皮微透析技術中，微透析探針具有“人造血管”的特點，探針植入皮下并與體內的藥物達到平衡后可直接反映皮膚中的藥物濃度。與傳統的藥動學分析方法相比，經探針透析膜過濾的透析液“信號分子”可以更加客觀地反映組織中的藥物代謝情況；且對皮膚幾乎無損傷。該技術具有在體(in vivo)、原位(in situ)取樣和能夠在線(on line)、實時(real time)檢測的優點，使其特別適用于藥物經皮吸收研究[6-7]。

本研究利用增量法(Gain法)和減量法(Loss法)校正皮膚線性探針和血液同心圓探針的體內回收率，建立可同步反映皮膚和血液中藥物濃度的微透析系統，并結合LC/MS分析技術，研究苦參堿凝膠經皮給藥制劑在皮膚和血液中的藥動學過程。

1 實驗材料

1.1 儀器

Agilent 6410 Triple Quad LC/MS系統(美國Agilent公司)；磁力攪拌器(予華儀器有限責任公司，鄭州)。

微透析設備 (BAS公司，USA)，包括：灌注器推進泵(Baby Bee Syringe Drive，MD1001)、灌注器(1 ml Bee Stinger Gastight Syringer，MD0100)、灌注器架(Bracket for Baby Bee，MD1002)、流速控制器(Work Bee Controller，MD1000，MD-1020)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7.4)含 Na2HPO43.191 g/L、 NaH2PO40.775 g/L、 NaCl 5.58 g/L；線性探針(膜長20 mm，膜截留相對分子質量：5000 000)、同心圓探針(自制，膜長10 mm，膜截留相對分子質量：5000 000)；實驗動物保溫墊(自制)。

1.2 試劑

苦參堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110805-201709)；苦參堿原料藥(西安華萃生物技術有限公司，純度98%，批號：SH20170120)；磷酸可待因對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：171203-201706)；苦參凝膠(貴陽新天藥業股份有限公司)； NaH2PO4·2H2O (廣東金砂化工廠，分析純)；Na2HPO4·12H2O(廣東金砂化工廠，分析純)； H3PO4(蘇州振亞化工廠，分析純)；甲酸胺(美國Sigma公司，色譜純)；乙腈(德國Merck公司,色譜純)；水為三蒸水。

1.3 實驗動物

SD大鼠，雄性，體重：180～220 g(海軍軍醫大學實驗動物中心，SPF級，動物合格證號：SYXK(滬)2017-0002)。

2 方法和結果

2.1 色譜與質譜條件

色譜條件：色譜柱：Agilent SB C18柱(2.1 mm×50 mm，3.5 μm)；流動相：甲醇-25 mmol/L甲酸胺 (75∶25,V/V)；流速：0.3 ml/min；柱溫：40℃；檢測波長：220 nm；進樣量：5 μl；運行時間：2 min；

質譜條件：離子源：ESI源；輔助霧化氣(N2)壓力：40 psi；毛細管電壓：4 000 V；干燥氣(N2)溫度：350℃；流量：10 L/min；正離子模式檢測；掃描方式為多反應監測(MRM)；碰撞誘導解離電壓 (CID)：35 eV(苦參堿)、28 eV(內標可待因)；用于定量分析的離子反應分別為：m/z249→148 (苦參堿)和m/z300→215(可待因)；碰撞能量：20 eV。

圖1 苦參堿LC-MS離子掃描質譜圖

圖2 可待因LC-MS離子掃描質譜圖

2.2 標準曲線及方法學考察

2.2.1標準曲線的制備

分別精密稱取苦參堿、可待因對照品(內標)適量，置于容量瓶中并定容，配制成濃度分別為3、1 μg/ml的母液，于4℃冰箱冷藏。精密吸取適量的苦參堿和可待因母液，并用PBS將苦參堿稀釋至1、5、10、50、100、500、1000 ng/ml的系列濃度(每個樣品中可待因含量均為20 ng/ml，按上述LC/MS條件依次進樣。以面積(A)對濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程A=0.0 897C-2.344，r=0.9999。結果表明，苦參堿濃度在1～1 000 ng/ml范圍內，吸收峰面積與濃度的線性關系良好。

2.2.2精密度實驗

取低、中、高濃度分別為10、100、500 ng/ml的苦參堿對照品溶液，分別于日內0、4、8、12、24 h和日間1、2、3 d按照“2.1”項下LC/MS條件進樣測定，并記錄苦參堿的吸收峰面積。日內精密度RSD分別為2.70%、1.79%、0.75%(n=6)，日間精密度RSD分別為3.55%、2.46%、1.45%(n=6),結果表明本方法精密度良好。

2.2.3穩定性考察

取濃度為100 ng/ml的苦參堿參比溶液，分別于0、2、4、6、8 h進行LC/MS檢測，各時間點的吸收峰面積結果依次為661、662、660、657、659，不同時間點的吸收峰面積相對標準偏差RSD值為0.29%(n=6)，表明樣品溶液在配制后8 h內具有良好的穩定性。

2.2.4加樣回收率實驗

精密量取濃度為10、100、500 ng/ml的苦參堿標準品溶液，并將以上3種濃度的標準品溶液分別加入到已知濃度的苦參堿樣品溶液中，測定混合溶液中苦參堿的總濃度，并計算樣品的加樣回收率。平均回收率分別為97.23%、98.76%、101.25%,RSD值分別為2.88%、2.24%、1.29%。結果表明苦參堿回收率良好，樣品測定的準確度符合方法學驗證的要求。

2.3 線性和同心圓探針的體外回收率

分別采用增量法和減量法探究藥物濃度對兩種探針的體外回收率影響。根據預試驗，將灌流液的灌注速度設為2 μl/min。

2.3.1皮膚線性探針體外回收率

增量法測定回收率：將皮膚線性探針的半透膜完全浸入到溫度為(37±0.5)℃、轉速為200 r/min的苦參堿磷酸緩沖鹽(PBS)溶液(Cin=10、20、50 ng/ml)中。以PBS平衡探針1 h后開始收集探針透析液，每次收集體積為40 μl，連續收集5次。根據“2.1”項下條件測定透析液中藥物濃度Cout。線性探針體外增量法回收率(RG%)的計算公式(1)如下：

RG%=Cout/Cin×100%

(1)

減量法測定回收率：將皮膚線性探針的半透膜完全浸入到溫度為(37±0.5)℃、轉速為200 r/min的PBS溶液中。分別以灌流速度為2 μl/min苦參堿PBS溶液(Cin=10、20、50 ng/ml)為灌流液，探針經灌流液平衡1 h后，每20 min收集一次透析液，并連續收集5次。根據“2.1項”LC/MS條件測定透析液中的藥物濃度Cout。線性探針體外減量法回收率(RL%)按照公式(2)計算：

RL%=(Cin-Cout)/Cin×100%

(2)

線性和同心圓探針的RG和RL的體外回收率結果如表1所示。

表1 皮膚線性探針體外回收率(n=5)

2.3.2血管同心圓探針體外回收率

增量法測定回收率：將血液同心圓探針的半透膜完全浸入苦參堿PBS溶液(Cin=50、100、200 ng/ml)中。其余測定同“2.3.1”項下增量法測定回收率操作。

減量法測定回收率：將血液同心圓探針的半透膜完全浸入PBS溶液中。分別以灌流速度為2 μl/min苦參堿PBS溶液(Cin=50、100、200 ng/ml)為灌流液。其余測定同“2.3.1”項下減量法測定回收率操作。同心圓探針的體外回收率結果如表2所示。

表2 血管同心圓探針體外回收率(n=5)

表1、表2的體外回收率結果顯示，以不同濃度的藥物作為灌流液或探針所處不同藥物濃度中，采用增量和減量兩種方法測定的線性和同心圓探針體外回收率基本一致，表明苦參堿的濃度對以上兩種探針的體外回收率無顯著性影響。

2.4 線性和同心圓探針的體內回收率

2.4.1手術方法

在實驗前24 h先將大鼠的腹部脫毛處理，用25%烏拉坦麻醉大鼠，麻醉給予量為：0.4 ml/100 g(ip)，大鼠麻醉后，將其固定于保溫墊上(37.5℃左右)。線性探針植入皮下的方法：在18G穿刺針引導下將線性探針半透膜埋入皮下。同心圓探針埋入頸靜脈方法：在大鼠頸部剪開1 cm左右的小口，用鑷子將頸靜脈鈍性分離，并將靜脈遠心端結扎，將同心圓探針插入血液充盈的血管，并用手術線將探針和靜脈固定，最后縫合傷口，消毒。

2.4.2皮膚探針的體內回收率校正

在穿刺針的引導下將線性探針的半透膜埋入皮下，用10、20、50 ng/ml(Cin)苦參堿的PBS溶液以2 μl/min的速度進行灌注。灌注平衡1 h后開始收集皮膚組織透析液，單次收集量為40 μl，并連續收集5次并測定組織透析液中的藥物濃度。皮膚探針的RL%結果如表3所示。

表3 皮膚線性探針體內回收率(n=5)

2.4.3同心圓探針體內回收率的校正

按照“2.4.1”項下手術方法將同心圓探針置于頸靜脈，按照“2.3.2”項下體外回收率的測定方法，分析灌注液濃度對同心圓探針體內回收率的影響，利用公式(2)計算同心圓探針的體內回收率(RL%)。結果如表4所示。

表4 血管同心圓探針體內回收率(n=5)

體內回收率實驗結果(表3、4)顯示，線性探針、同心圓探針在以不同濃度的苦參堿進行灌注得到的體內回收率(RL%)之間無顯著性差異，表明藥物濃度對回收率影響較小，經不同灌注濃度處理的探針回收率之間無顯著性差異。

皮膚線性探針和血液同心圓探針的體內平均RL%分別為(42.7±2.4)%和(25.0±1.9)%；同種探針的體外回收率(RG%和RL%)結果基本一致，因此可以采用體外增量回收率(RG%)和減量回收率(RL%)的校正系數以及體內減量回收率(RL%)計算兩種探針的體內增量回收率(RG%)，并利用校正的體內回收率(Rin vivo)和測得的皮膚組織和血液透析液濃度(Cdialysis)換算體內藥物的真實濃度(C)，計算公式如公式(3)所示。

C=Cdialysis/Rin vivo

(3)

2.5 苦參堿凝膠在皮膚、血液中的藥動學 [8-10]

將SD大鼠腹部脫毛，待皮膚恢復24 h后，根據“2.4.1”的手術方法將線性探針植入皮下、將同心圓探針植入頸靜脈中，建立可同時分析藥物在皮膚和血液中藥動學過程的皮膚-血液雙位點同步微透析系統。以速度為2 μl/min的PBS平衡探針1 h，于大鼠腹部給予3% 苦參堿凝膠，并用聚乙烯薄膜覆蓋，給藥劑量：4.5 mg/cm2，給藥面積：3×4 cm2。在給藥后收集透析液，以收集40 μl為一個樣品收集間隔，并進行定量，并連續收集12 h。根據公式(3)換算成其在皮膚組織液和血液中的實際藥物濃度。苦參堿在皮膚和血液中的藥物濃度-時間曲線如圖3、4所示。使用Kinetica5.0軟件分析在給藥部位(皮膚)和全身(血液)中的藥動學參數，結果如表6所示。

圖3 皮膚中苦參堿濃度-時間曲線圖

圖4 血液中苦參堿濃度-時間曲線圖

表6 經皮給藥后苦參堿在皮膚和血液中的主要藥動學參數

藥動學結果顯示，皮膚給予苦參堿凝膠后，皮膚中的藥物濃度顯著高于血液中的濃度，且皮膚中的藥物濃度變化更加平穩，間接反映出苦參堿凝膠制劑良好的透皮能力和局部治療效果。

3 討論

微透析技術可直接對細胞外液進行采樣，廣泛應用于動物和人體藥動學研究。可以同步檢測藥物在不同身體部位的代謝過程，具有傳統藥動學分析方法不可比擬的優勢。然而，其在中藥透皮遞藥系統的藥動學研究中應用并不廣泛。課題組建立皮膚-血液雙位點同步微透析系統，并用于研究苦參堿在皮膚組織和血液中的吸收和代謝情況。通過體外和體內評價，探討了微透析系統結合LC/MS技術分析苦參堿藥動學的可行性。

微透析探針的體內和體外回收率是該方法真實反映體內藥物濃度的關鍵。灌注液的灌流速度、組織溫度、取樣部位、待測藥物理化性質、透析膜以及藥物與透析膜的化學交互作用等均可影響微透析探針的回收率。微透析探針的體外相對回收率受到透析膜內外濃度差形成的擴散、清除等影響；而影響體內回收率的因素更多，包括動物間的個體差異、血管探針插入頸靜脈的深度，探針半透膜與血液的接觸面積等[11]。本研究建立的皮膚-血液雙位點同步微透析技術可以較好地解決這一問題，獲得滿意的回收率，可用于苦參堿凝膠的藥動學研究。