金線蓮及其混偽品中總黃酮含量的比較研究

張 超，易 駿，張若青，楊淑玲，葉 齊，吳建國，吳錦忠，吳巖斌，鄭承劍

(1.福建中醫藥大學藥學院,福建 福州 350122；2.福建教育學院理科部,福建 福州 350001；3.中國人民解放軍天津康復療養中心464醫院藥劑科，天津 300381；4.福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002；5.海軍軍醫大學藥學院生藥學教研室，上海 200433)

金線蓮(Herba Anoectochilus)是福建特色中草藥，來源于蘭科(Orchidaceae)金線蘭屬植物金線蘭Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl.的全草，具有清熱解毒、涼血、祛風利濕等功效[1-2]。現代藥理研究表明金線蓮具有免疫調節、抗腫瘤、降血糖、抗氧化、保肝、抗骨質疏松等藥理作用[3-11]。除金線蘭外，其他金線蘭屬植物包括：臺灣銀線蘭A.formosanus、恒春銀線蘭A.koshunensis、浙江金線蘭A.zhejiangensis、峨眉金線蘭A.emeiensis、滇越金線蘭A.chapaensis等，金線蘭屬植物在民間也混做金線蓮使用[12-13]。另外，由于藥材形態特征相似，在市場上常有一些同科不同屬近緣種植物如：斑葉蘭屬植物斑葉蘭GoodyeraschlechtendalianaRchb.f.、大花斑葉蘭G.biflora(Lindl.) Hook.f.、毛梗斑葉蘭G.hispidaLindl.、小小斑葉蘭G.yangmeishanensiT.P.lin、天全斑葉蘭G.wuanaT.Tang et F.T.wang、血葉蘭屬植物血葉蘭Ludisiadiscolor(Ker-Gawl.) A.Rich.，經過干燥加工后作為金線蓮的偽品[13]。黃酮類成分是金線蓮主要的活性成分之一，具有抗氧化和降血糖等生物活性，也是衡量該藥材質量的重要指標[14-15]。雖然已有文獻報道過金線蘭、臺灣銀線蘭和滇越金線蘭中的黃酮類成分[12,16-17]，但是關于其他金線蓮混偽品中黃酮類成分卻鮮見報道。本研究分析金線蓮及其混偽品中總黃酮含量的差異，將為金線蓮資源的開發利用和藥材質量控制提供參考依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UV-1800紫外可見分光光度計(日本島津公司)；RE-2000A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；AB204-N電子天平(METTLER TOLEDO)；DFT-200手提式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)。

1.2 試劑

金線蓮及其混淆品采自不同省市，經福建中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室黃澤豪教授鑒定；蘆丁(成都普瑞法科技開發有限公司，批號：15010412，含量大于98%)；硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇、乙醇為分析純；蒸餾水(實驗室自制)。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品5.38 mg,置25 ml 容量瓶中，加10 ml乙醇溶解，加水至刻度，搖勻，即得每1 ml 中含蘆丁0.2152 mg 的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取不同樣品粉末約1.0 g，精密稱定，置索氏提取器中，加70 ml石油醚加熱回流提取至提取液無色，棄去石油醚液，藥渣揮去石油醚，加95%乙醇繼續提取至無色，提取液旋轉濃縮至干，加入95%乙醇超聲溶解，定容，得總黃酮上清液。

2.3 標準曲線的制備

精密量取對照品溶液1、2、3、4、5、6 ml，分別置25ml容量瓶中，加水至6.0ml，再加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應的試劑為空白，在510 nm波長處測定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標，相應濃度(C)為橫坐標，計算得到總黃酮含量測定的回歸方程：A=0.0111C-0.0097(r= 0.9996)，結果表明蘆丁在8.61～51.65 μg/ml范圍內線性良好。

2.4 方法學考察

2.4.1精密度試驗

精密吸取“2.1”項下制備的蘆丁對照品溶液(215.2 μg/ml)6份，按“2.3”項下方法測定吸光度,計算結果顯示6份蘆丁對照品反應后的吸光度的RSD為0.46%，表明該方法的精密度良好。

2.4.2重復性試驗

取同一批樣品(序號8)1.0 g，平行稱取6份，按“2.2”項下處理，按“2.3”項下方法測定吸光度,計算結果顯示6份金線蓮樣品總黃酮反應體系的吸光度RSD為2.66%，表明該方法測定金線蓮總黃酮的含量重復性良好。

2.4.3穩定性試驗

取同一批樣品(序號8)1.0g，按“2.2”項下處理，按“2.3”項下方法測定吸光度，分別每隔10 min記錄吸光度,計算結果顯示該金線蓮總黃酮反應體系的吸光度在120 min內RSD為0.97%，表明該反應體系在120 min內穩定性良好。

2.4.4回收率試驗

取已知含有量的樣品(序號8)0.5 g，平行稱定6份，按照“2.2”項下供試品溶液的制備方法提取總黃酮，分別取3 ml供試液置于6支25 ml容量瓶中，再分別加入2.37 mg蘆丁對照品，按“2.3”項下方法測定吸光度,并計算總黃酮含量，計算回收率和RSD。回收率結果見表1，結果顯示，金線蓮總黃酮的平均回收率為98.85%，RSD為2.91%，表明金線蓮總黃酮的加樣回收率良好。

表1 金線蓮總黃酮加樣回收試驗結果(n=6)

2.5 樣品含量的測定

精密吸取供試品溶液3 ml置25 ml容量瓶中，照“2.3”項下的方法，自“加水至6.0 ml”起，依法測定吸光度，每批樣品平行3次，根據標準曲線計算總黃酮含量，結果見表2。

7批來源于野生金線蓮的樣品總黃酮含量在5.90～15.17 mg/g之間，均值為9.93 mg/g，RSD為33.04%，來源于廣東清遠的野生金線蓮樣品總黃酮含量最高，為15.17 mg/g；5批組培金線蓮樣品的總黃酮含量在3.89～5.57 mg/g之間，均值為4.50 mg/g，RSD為15.33%；5批組培臺灣銀線蘭樣品的總黃酮含量在3.66～9.91 mg/g，均值為6.59 mg/g，RSD為44.30%；其余7種野生金線蘭屬樣品總黃酮含量在6.88～9.19mg/g之間；4種斑葉蘭屬植物(斑葉蘭、大花斑葉蘭、小小斑葉蘭、天全斑葉蘭)和1種血葉蘭屬植物(血葉蘭)，它們的總黃酮含量分別為21.96、9.66、11.10、12.70和4.82mg/g。

表2 金線蓮及其混偽品中總黃酮的含量(n=3)

注：AR 8-12分別是來自不同企業的組培金線蘭；AF 1-5分別是來自不同企業的組培臺灣銀線蘭；其余樣品均為野生。

3 討論和結論

金線蓮已成為福建省特色中藥材“福九味”之一，但其來源混雜、混偽品多，導致藥材質量良莠不齊，影響到臨床用藥的有效性和安全性。目前，市場上金線蓮的主要偽品為斑葉蘭屬植物和血葉蘭的全草，主要的混淆品或地方習用品為臺灣銀線蘭、滇越金線蘭等金線蘭屬植物。本研究采集了30批次不同來源的金線蓮及其混淆品和偽品，包括金線蘭、臺灣銀線蘭、興仁金線蘭、麗蕾金線蘭、南丹金線蘭、長片金線蘭、滇南金線蘭、短唇金線蘭、高金線蘭、斑葉蘭、大花斑葉蘭、小小斑葉蘭、天全斑葉蘭、血葉蘭，其中短唇金線蘭和高金線蘭為課題組在中國首次發現的金線蘭屬植物，其植物形態與金線蘭極其相似，在云南省也被當作金線蓮使用[18-19]。

金線蓮為全草類中藥，色素較多，本試驗通過石油醚回流提取后，再采用乙醇提取總黃酮，可以減少其他類成分對總黃酮含量測定的干擾。試驗結果顯示，金線蓮及其混淆品、偽品的總黃酮含量存在差異。12批次的金線蓮總黃酮含量在3.89～15.17 mg/g之間，其余金線蓮混淆品和偽品的總黃酮含量在3.66～21.96 mg/g之間。不同產地的野生金線蓮總黃酮含量存在差異，這可能與其生長年限和生長環境等因素有關；不同廠家的組培金線蓮和臺灣銀線蘭的總黃酮含量差別較大，這可能與不同廠家生產組培品所用的外植體不同有關，此外組織培養所用的培養基、光照、溫度等也可能對總黃酮的積累產生影響；金線蓮與其混淆品、偽品中總黃酮的含量差異可能與種的不同及其生長環境有關。黃酮含量的高低，僅可作為金線蓮質量評價的標準之一，若要全面地評價金線蓮的質量,還應當對其多糖、內酯苷等成分進行系統的研究。