高效液相色譜法測(cè)定雙料喉風(fēng)散中靛藍(lán)和靛玉紅含量

王婷婷，李 玲，陳乃江

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 連云港 222000）

雙料喉風(fēng)散是由人工牛黃、青黛、黃連、珍珠、山豆根等9味中藥組方的中藥復(fù)方制劑，主要用于治療肺胃熱毒熾盛所致咽喉腫痛、口腔糜爛、齒齦腫痛、鼻竇膿腫、皮膚潰爛等癥［1］，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第十六冊(cè)）》，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的檢驗(yàn)項(xiàng)目有性狀、理化鑒別和散劑檢查［1-2］，無具體成分的定量項(xiàng)，不能客觀地反映雙料喉風(fēng)散的質(zhì)量。處方中青黛的主要活性成分為靛藍(lán)和靛玉紅［3］，為其主要有效成分，故被選為測(cè)定指標(biāo)。本研究中參照文獻(xiàn)［4-6］，建立了測(cè)定雙料喉風(fēng)散中靛藍(lán)和靛玉紅含量的高效液相色譜法，該方法操作簡便、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，可有效控制該制劑質(zhì)量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Sartorius BP211D型電子分析天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司）；KH-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（700 W，40 kHz，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；超純水儀（Milli-Q 公司）。

1.2 試藥

靛藍(lán)對(duì)照品（批號(hào)為 110716-201612，純度為98.7% ），靛玉紅對(duì)照品（批號(hào)為 110717-201805，純度為99.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；雙料喉風(fēng)散（市售，廣東嘉應(yīng)制藥股份有限公司，批號(hào)分別為20170302，20170406，20171205，規(guī)格為 2.2 g）；乙酸銨為分析純，甲醇和DMF為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -0.02 mol/L 乙酸銨（75 ∶25，V/V）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：289 nm。

2.2 溶液制備

避光操作。稱取靛玉紅對(duì)照品10.64 mg，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 mL置100mL棕色容量瓶中。稱取靛藍(lán)對(duì)照品11.31mg，精密稱定，置同一容量瓶中，加DMF溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。取樣品（批號(hào)為20170406）約0.5 g，精密稱定，置25 mL棕色容量瓶中，加DMF適量，超聲處理20 min，加DMF稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方取缺青黛的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

圖1 雙料喉風(fēng)散高效液相色譜圖

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下3種溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，供試品溶液色譜圖中，靛藍(lán)色譜峰與相鄰色譜峰達(dá)到了基線分離，陰性對(duì)照品溶液在與靛藍(lán)峰、靛玉紅峰相同保留時(shí)間處無相應(yīng)色譜峰，陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖1。

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1，2，4，5，6，8，10 mL，分別置 25 mL 棕色容量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻。依次進(jìn)樣，記錄色譜圖，以對(duì)照品質(zhì)量濃度（，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，Y靛藍(lán)=60 183-25 168（r=0.999 9，n=7），Y靛玉紅=63 191-4 404.2（r=0.999 7，n=7）。結(jié)果表明，靛藍(lán)與靛玉紅質(zhì)量濃度分別在 4.52 ～45.20 μg/mL 和 0.426 ～4.260 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果靛藍(lán)和靛玉紅峰面積的RSD分別為 0.71%和 0.86%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液（批號(hào)為20170406），分別于 0，2，4，6，8，10，12 h 時(shí)進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。結(jié)果靛藍(lán)和靛玉紅峰面積的RSD分別為1.12%，1.43%（n=7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一批（批號(hào)為20170406）樣品，按2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果靛藍(lán)和靛玉紅的平均含量分別為1.1090mg/g和0.1021mg/g，RSD分別為1.04%和1.36%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為20170406）9份，分別置50 mL容量瓶中，每份0.5 g，精密稱定，3份1組，分別精密加入2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液4，5，6 mL。按供試品溶液制備方法制備溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL進(jìn)樣測(cè)定，按擬訂色譜條件測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中靛藍(lán)和靛玉紅含量。結(jié)果見表2。

表2 雙料喉風(fēng)散中靛藍(lán)和靛玉紅的含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3 討論

本研究中考察了氯仿、甲醇、DMF作為提取溶劑，超聲提取、加熱回流提取方法及20，30，40 min超聲提取時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果表明，采用DMF提取效率最高，超聲提取和回流提取所得靛藍(lán)和靛玉紅的含量接近，超聲提取的樣品雜質(zhì)峰相對(duì)較少，超聲提取20 min后測(cè)定值達(dá)到穩(wěn)定。因超聲提取比回流提取更簡便，故本研究采用DMF作為提取溶劑，超聲提取20 min。

通過DAD全波長掃描對(duì)照品溶液，發(fā)現(xiàn)靛藍(lán)、靛玉紅分別在285 nm和289 nm波長處有最大吸收。比較285 nm和289 nm波長下的色譜圖，在289 nm波長處樣品主成分峰與其余雜質(zhì)峰分離度好，干擾較少，靈敏度高，且樣品中靛玉紅的峰面積遠(yuǎn)小于靛藍(lán)，故采用289 nm作為測(cè)定波長。

本研究中建立的高效液相色譜法可同時(shí)測(cè)定雙料喉風(fēng)散中靛藍(lán)和靛玉紅的含量，且方法精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度均良好，可用于檢測(cè)不同批次的樣品，為更好地控制雙料喉風(fēng)散的質(zhì)量提供了參考。