Rh缺失型D
--個體及家庭成員的血型鑒定與遺傳分析

燕 磊，李潔平，趙震焱

（鄭州市第二人民醫院，河南鄭州 450006）

Rh血型系統基因由R H C E基因、RHD基因組成，位于人類染色體1p34.3-1p36.1短臂上，是當前已知的血型系統中除ABO血型以外的具較強免疫原性的血型，并具復雜多態性[1]。Rh缺失型D是Rh血型系統中極為罕見的基因變異型，其紅細胞表面僅有D抗原表達，C抗原、c抗原、E抗原、e抗原表達均缺失[2]。在輸血醫學領域，Rh缺失型D--的個體若被Rh抗原致敏可產生多種Rh抗體針對C抗原、c抗原、E抗原或e抗原，因此發生嚴重溶血性輸血反應[3]。當前，關于Rh缺失型D--的臨床報道多為Rh缺失型D--孕婦個體引起的胎兒或新生兒溶血性疾病[4-5]；并且，當前國內關于Rh缺失型D--表型的研究多為個案報道[6]。鑒于此，本研究鑒定分析了本院收治的Rh缺失型D--個體及家庭成員的血清學及遺傳背景，旨在為中國人群的血型基因結構、多態性等研究積累更多的臨床資料。

1 資料與方法

1.1 病例資料 研究對象為2018年11月在本院分娩后大出血需輸血的產婦1名。該名產婦年齡29歲，既往有輸血史，孕2胎產2胎。2014年分娩1胎，女嬰，健康成活；2018年12月分娩1胎，男嬰，男嬰產后進行性皮膚黃疸加重。男性新生兒實驗室檢查紅細胞計數1.24×1012/L，Hb 56g/L，網織紅細胞比值0.35，有核紅細胞140個/100個白細胞，血清總膽紅素260.36μmol/L，臨床初診新生兒溶血病(hemolytic disease newborn，HDN)。為查明男嬰發生HDN的原因、為產婦提供相配的血液輸注，采集產婦及其家屬（其夫、患兒、其女、其母、其姐、其兄、其妹，未采集到其父標本）血液標本進行交叉配血檢查，標本送達時患兒已因病情過重死亡。

1.2 方法

1.2.1 細胞及試劑：IgM型單克隆抗-A、抗-B、抗-D血清及抗人球蛋白試劑、篩選細胞，均購自上海血液生物醫藥有限公司；反定型紅細胞，購自長春博德生物醫藥有限公司；譜細胞、IgM型單克隆抗-C、抗-c、抗-E、抗-e血清，購自美國IMMUCOR公司；人源抗-C、抗-c、抗-E、抗-e血清自制；基因組DNA提取試劑盒、PCR-SSPCDE試劑盒，均購自德國Inno-train公司；引物均為上海生物工程公司合成；直接抗人球蛋白試驗實驗凝膠卡購自西班牙Grifols公司。

1.2.2 血型鑒定：獲得研究對象知情同意后采集5ml空腹肘靜脈血，制備5%紅細胞懸液。試管法鑒定ABO血型、Rh血型，對IgM型單克隆抗-C、抗-c、抗-E、抗-e初篩顯示C、c、E或e抗原陰性的標本再次用人源抗-C、抗-c、抗-E、抗-e血清進行吸收放散實驗，明確被檢紅細胞上有無對應抗原；直接抗人球蛋白試驗DAT實驗凝膠卡對樣本進行直接抗人球蛋白（DAT）試驗。

1.2.3 基因型分析：嚴格參照基因組DNA提取試劑盒說明書提取產婦及其家庭成員EDTA抗凝全血中的基因組DNA，調整濃度至50ng/μ l。參照PCR-SSPCDE試劑盒說明書對產婦及其家庭成員RHD基因第1（PCR產物大小124bp，檢測基因D1）、2（149305bp，D2、C、D3）、3（139bp，D4）、4（152303bp，D5、psi）、5（130bp，D6）、6（122bp，D7）、7（186bp，D9）、8（147bp，D10）、9（106298bp，C、“W”）、10（145bp，c）外顯子，以及RHCE基因特征性片段11（157bp，E）、12（155bp，e）、13（166107124bp，D1Ⅶ、DHMi）、14（166165bp，D1Ⅶ、DAU）、15（139135bp，DNB、697A）、16（139133bp，DNB、697C）進行PCR擴增。反應體系：雙蒸水6μl、引物混合物3 μl、Taq酶0.08μl，DNA 1 μl。反應條件：94℃ 20min 1個循環；94℃ 20s、70℃ 60s，5個循環；94℃20s、65℃ 60s、72℃ 45s，10個循環；94℃ 20s、61℃ 50s、72℃45s，20個循環；72℃ 5min ，1個循環；10℃保存PCR產物。取10 μ l PCR產物直接點樣于含0.7μg/ml EtBr的2%瓊脂糖凝膠，電泳20min，8～10V，凝膠成像系統紫外光下拍照記錄，每個反應管內均含434bp內對照物，電泳后所有陰性反應管出現該對照帶。

2 結果

2.1 產婦及其家庭成員血型鑒定結果 產婦、其丈夫、患兒、其女、其母、其姐、其兄ABO血型鑒定結果顯示均為A型血，其妹為AB型；Rh血型見表1：

表1 被檢對象血型鑒定結果

2.2 產婦及患兒的DAT實驗及抗人球蛋白試驗 產婦DAT實驗陰性，患兒DAT實驗陽性（++）。抗體鑒定顯示產婦、患兒血清與譜細胞在鹽水介質中均不凝集，為陰性。產婦抗人球蛋白試驗強陽性，在抗人球蛋白試驗中與所有細胞均發生強凝集（+++），產婦自身對照無凝集。

2.3 產婦及其家庭成員的RHD基因分型 產婦及其家庭成員PCR結果證實，產婦RHD基因未見異常，亦未檢出RHCE基因的特異性序列；其他家庭成員均有正常表型及RHCE基因產物，且產婦及其家庭成員PCR結果與血型學表型基因相符。見表2-3、附圖。

表2 PCR-SSP CDE檢測試劑盒PCR產物及檢測基因

表3 產婦及其家庭成員的RHD基因分型

附圖 產婦及其家庭成員的RHD基因分析圖

3 討論

本研究病例個體及家族成員血型鑒定結果顯示，產婦、其夫、其子的ABO血型均為A型，可明確排除母嬰ABO血型不合引起的HDN；并且，產婦Rh血型為D--，存在C、c、E、e抗原缺失現象，其夫及兩子女Rh血型均為D+C+c-E-e+，均有C、e抗原。且結果顯示產婦DAT實驗陰性，患兒DAT實驗陽性（++）；抗體鑒定陰性；產婦抗人球蛋白試驗強陽性，抗人球蛋白試驗中與所有細胞均發生強凝集（+++），產婦自身對照無凝集。因此，可以排除產婦存在自身抗體。該產婦既往有妊娠及輸血史，且既往有研究報道Rh缺失型D--個體通過妊娠、輸血或可產生抗抗-Rh17抗體，即針對Rh高頻率抗原的抗體，結合患兒HDN實驗均為陽性，證實HDN是免疫學原因所致。因此，類Rh缺失型D--血液中存在針對高頻抗原的抗體，與一般紅細胞均可發生凝集反應，僅與RHD--、Rhnull、Rhmod細胞不反應，因此，尋找相配血液供產婦輸注相當困難。這也是本研究采集其家系血清的重要原因，但在產婦家系中并未發現Rh缺失型D--個體。

既往有研究指出[7-8]，Rh缺失型D--多因近親婚配導致，但對本研究中產婦家系進行調查后發現，該產婦并無明顯證據證實其Rh缺失型D--是近親婚配所致。但基于血清學檢查的局限性，許多Rh缺失型D--血清學檢測為純合子，但分子生物學方法檢測卻為雜合狀態，且幾乎所有的Rh缺失型D--均至少有一條順式雜合單倍體[9-10]。為此，本研究進一步采用PCR-SSP技術分析了產婦及其家庭成員的RHD和RHCE基因。結果顯示，產婦及其家庭成員的PCR-SSP結果與血型學表型基本符合，RHD基因9個外顯子的PCR擴增產物亦均顯示為正常RHD基因，并未見RHCE基因插入、互換現象；產婦RHCE基因特異性序列PCR擴增產物分析顯示未見RHCE基因特異性序列，提示產婦的RHCE基因極有可能大部分或全部缺失，但其他家庭成員則均有正常RHCE基因表型及RHCE基因PCR產物；同時，PCR產物分析結果還顯示其母、其兄皆出現Dpsi條帶，與產婦及其姐妹的PCR產物結果矛盾，不能從遺傳學角度解釋，考慮PCR假陽性。

綜上所述，產婦其母、其兄、其姐、其妹及其子、其女均有正常RHCE基因表型，而產婦未見RHCE基因，分析Rh缺失型D--的原因或可能為產婦父母分別攜帶一條D--單倍型，為RHCE基因缺失型雜合狀態，遺傳時將D--單倍型遺傳給產婦所致。擬在今后的研究中檢測該產婦家庭成員的RHD基因、RHCE基因缺失型雜合狀態，并對產婦cDNA作RHCE基因全長測序，以深入探究。