OSU-03012對人結腸癌LoVo細胞增殖侵襲及COX-2、VEGF、MMP-2表達的影響

王 虹

（鄭州市第七人民醫院，河南鄭州 450000）

結腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床上常見的消化道惡性腫瘤之一[1]。磷酸肌醇3激酶/磷脂酰肌醇依賴性激酶1/蛋白激酶B（phosphoinositide-3 kinase/phosphoinositide-dependent kinase 1/protein kinase B，PI3K/PDK1/AKT）信號通路與結腸癌的發生、發展密切相關[2]。環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是前列腺素E2合成的限速酶，通過介導PI3K/PDK1/AKT信號通路參與多種惡性腫瘤的發生，被視作潛在的惡性腫瘤治療靶點[3]。化合物OSU-03012為COX-2抑制劑的衍生物，有研究發現其可有效抑制結腸癌細胞的增殖、侵襲，并促進結腸癌細胞凋亡[4]，但該研究并未觀察OSU-03012對COX-2的作用。為此，本研究探討了OSU-03012對人結腸癌LoVo細胞增殖、侵襲及COX-2、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)表達的影響，以期為尋找結腸癌新的治療途徑提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 人結腸癌細胞株LoVo，購自中國科學院上海細胞庫；MTT試劑盒，購自上海威奧生物科技有限公司；Transwell小室和Matrigel膠，購自Corning公司（美國）；Trizol試劑，購自天根生化有限公司；反轉錄試劑盒，購自Takara公司（日本）；COX-2、VEGF、MMP-2、β-actin一抗，購自優寧維生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒及二抗購自碧云天生物技術研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和分組：LoVo細胞采用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養液，在37℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞融合度達到80%時，分別使用0μmol/L、3μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的OSU-03012處理細胞作為不同分組。

1.2.2 MTT法檢測LoVo細胞的增殖情況：將LoVo細胞接種至96孔板，調整細胞濃度為1×104個/孔。使用不同濃度的OSU-03012分別處理細胞24h、48h、72h。根據MTT試劑盒說明書操作步驟處理細胞，最后使用酶標儀在波長570nm處檢測吸光度值。每組設3個復孔。

1.2.3 Transwell法檢測LoVo細胞的侵襲能力：取生長狀態良好的LoVo細胞，采用不含血清的DMEM/F-12培養基，在37℃、5% CO2培養箱中培養12h，使細胞處于饑餓狀態，然后收集細胞調整濃度至2×105個/ml。Transwell上室中加入150μl細胞懸液，下室中加入600μl含不同濃度OSU-03012的培養液（含10%胎牛血清），每組設置3個復孔。在37℃、5% CO2培養箱中繼續培養24h后，棄去培養液，用棉簽將小室內殘留細胞擦去。甲醇固定10min后，結晶紫染色20min。在顯微鏡下觀察穿過基底膜的細胞，拍照并隨機選取6個視野統計細胞數量。

1.2.4 qRT-PCR法檢測LoVo細胞COX-2、VEGF、MMP-2 mRNA的表達情況：各組細胞加入不同濃度OSU-03012后，在37℃、5% CO2培養箱中采用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養液繼續培養24h。采用Trizol試劑提取細胞總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書操作將RNA逆轉錄為cDNA，根據SYBR GREEN 定量PCR說明書步驟進行qPCR擴增。擴增條件：95℃預變性30s，1個循環；95℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環；72℃延伸5min，1個循環；4℃保存10min。以β-actin為內參，COX-2、VEGF、MMP-2 mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各檢測基因引物序列及產物大小見表1：

表1 各基因引物序列和產物大小

1.2.5 Western Blot法檢測LoVo細胞COX-2、VEGF、MMP-2蛋白的表達情況：各組細胞加入不同濃度OSU-03012后，在37℃、5% CO2培養箱中采用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養液繼續培養24h。然后棄去培養液，胰酶消化處理后，將細胞轉移至1.5ml離心管，加入500μl細胞裂解液，充分吹打細胞，然后冰上靜置30min，12000rpm離心10min取上清，提取細胞總蛋白并使用BCA試劑盒進行定量。取蛋白提取液（含蛋白40μg）上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳(5%濃縮膠，12%分離膠)，電泳完畢后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶常溫下封閉2h，加入一抗（COX、VEGF一抗稀釋比例為1：500，MMP-2一抗稀釋比例為1：800，β-actin一抗稀釋比例為1：1000）4℃孵育過夜，加入二抗常溫孵育1h，顯影液顯影后曝光并拍照，采用凝膠成像儀掃描顯影后的蛋白條帶，以β-actin為內參，以目的條帶與內參條帶灰度值的比值作為各目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計分析 計量數據用平均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗；組內不同時間點比較采用重復測量數據的方差分析。使用GraphPad Prism 6.0進行圖片制作與統計分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OSU-03012對結腸癌LoVo細胞細胞增殖能力的影響 OSU-03012作用結腸癌LoVo細胞24h、48h和72h，隨著藥物濃度的增加LoVo細胞的增殖能力逐漸降低，相同時間點不同濃度間兩兩比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2：

表2 不同濃度OSU-03012作用不同時間結腸癌LoVo細胞的增殖能力（±s ，n=3）

表2 不同濃度OSU-03012作用不同時間結腸癌LoVo細胞的增殖能力（±s ，n=3）

與0μmol/L組比較：1)P＜0.05；與3μmol/L組比較：2)P＜0.05；與5μmol/L組比較：3)P＜0.05

組別 24h 48h 72h 0μmol/L組 0.526±0.035 0.714±0.026 0.961±0.047 3μmol/L組 0.505±0.032 0.642±0.0311) 0.848±0.0431)5μmol/L組 0.389±0.0181)2) 0.485±0.0271)2) 0.573±0.0391)2)10μmol/L組 0.314±0.0131)2)3) 0.394±0.0101)2)3) 0.468±0.0351)2)3)

2.2 OSU-03012對結腸癌LoVo細胞侵襲能力的影響0μmol/L組、3μmol/L組、5μmol/L組和10μmol/L組LoVo細胞穿過基底膜的細胞數分別為（326±23）個、（304±18）個、（221±15）個和（142±13）個，穿過基底膜的細胞數量組間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1：

圖1 Transwell法結果（×200）

2.3 OSU-03012對LoVo細胞COX-2、VEGF、MMP-2 mRNA表達的影響 不同濃度OSU-03012作用LoVo細胞24h，LoVo細胞COX-2、VEGF、MMP-2 mRNA的表達水平逐漸降低，不同濃度間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3：

表3 OSU-03012對LoVo細胞COX-2、VEGF、MMP-2 mRNA表達的影響（±s ，n=3）

表3 OSU-03012對LoVo細胞COX-2、VEGF、MMP-2 mRNA表達的影響（±s ，n=3）

與0μmol/L組比較：1)P＜0.05；與3μmol/L組比較：2)P＜0.05；與5μmol/L組比較：3)P＜0.05

組別 COX-2 VEGF MMP-2 0μmol/L組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 3μmol/L組 0.81±0.061) 0.84±0.061) 0.88±0.071)5μmol/L組 0.68±0.051)2) 0.72±0.041)2) 0.74±0.041)2)10μmol/L組 0.52±0.021)2)3) 0.58±0.041)2)3) 0.62±0.051)2)3)F 29.215 22.412 16.933 P 0.001 0.002 0.003

2.4 OSU-03012對LoVo細胞COX-2、VEGF、MMP-2蛋白表達的影響 不同濃度OSU-03012作用LoVo細胞24h，LoVo細胞COX-2、VEGF、MMP-2蛋白的表達水平逐漸降低，不同濃度間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2：

圖2 OSU-03012對LoVo細胞COX-2、VEGF、MMP-2蛋白表達的影響

3 討論

PI3K/PDK1/AKT信號通路與腫瘤的發生、發展密切相關，PDK1是該通路的關鍵蛋白，抑制PDK1激活可能會阻斷信號通路的轉導，起到抗腫瘤效應[5]。OSU-03012是PDK1抑制劑，體外研究發現可通過阻斷PI3K/PDK1/AKT信號通路抑制多種惡性腫瘤細胞系的增殖，并促進細胞凋亡[6]，但其對結腸癌細胞系有無影響尚不明確。

本研究分別采用MTT法、Transwell法檢測了OSU-03012對人結腸癌LoVo細胞增殖、侵襲的影響，發現OSU-03012干預可明顯抑制LoVo細胞的增殖和侵襲能力，且OSU-03012濃度越高對LoVo細胞增殖和侵襲能力的抑制作用越明顯。為進一步探討OSU-03012發揮作用的可能分子機制，本研究觀察了OSU-03012對LoVo細胞COX-2、VEGF、MMP-2表達的影響，結果發現，無論是在基因水平還是蛋白水平，OSU-03012干預下LoVo細胞COX-2、VEGF、MMP-2的表達均明顯降低，且隨著OSU-03012濃度的升高，三者的表達水平逐漸降低。COX-2是前列腺素E2合成的限速酶，在正常結腸上皮細胞中表達水平低，但在結腸癌組織中異常高表達，參與結腸癌的侵襲、轉移過程，而COX-2抑制劑能抑制結腸癌細胞的侵襲、轉移[7]；VEGF在血管內皮細胞中廣泛表達，可誘導血管生成和內皮細胞增殖、遷移，與腫瘤細胞的生長、浸潤等過程相關；MMP-2是基質金屬蛋白酶家族的重要成員，可通過降解細胞外基質為腫瘤的局部侵襲提供有利條件[8]。由此可見，COX-2、VEGF和MMP-2均與癌細胞的增殖、侵襲、遷移等惡性生物學行為有關。而本研究結果提示，OSU-03012可抑制結腸癌LoVo細胞增殖、侵襲的能力，其發揮作用的分子機制可能與下調COX-2、VEGF和MMP-2的表達有關。