大孔吸附樹脂提取分離去甲基萬古霉素的工藝研究

去甲基萬古霉素是我國唯一一個自主研制并成功應(yīng)用于臨床的糖肽類抗生素，其結(jié)構(gòu)比萬古霉素在亮氨酸部位少 1 個甲基，見圖1。

圖1 去甲基萬古霉素結(jié)構(gòu)式

去甲基萬古霉素具有和萬古霉素相同的抗菌譜和相似的抗菌活性，對耐青霉素G及多種抗生素的金葡球菌、表球菌、溶血性鏈球菌、草綠色鏈球菌、肺炎球菌及腸球菌等均有強大的抗菌作用,對厭氧的難辨梭狀芽孢桿菌亦有較好的抗菌作用,對炭疽桿菌、白喉桿菌等亦敏感,屬速效殺菌藥[1]。

目前萬古霉素的分離純化方法有大孔樹脂吸附分離法[2]、沉淀法[3]、色譜制備法[4]、磁性親和吸附法[5]、雙水相萃取法[6]、反膠團萃取法[7]等，也可將其中幾種方法綜合運用[8]。色譜制備法、磁性親和吸附法成本較高，雙水相萃取法、沉淀法、反膠團萃取法影響因素較復雜，提取率不高。大孔樹脂吸附分離法較其它方法具有一定的優(yōu)越性：(1)影響因素少，工序簡單，操作方便；(2)提取率高，去除雜質(zhì)能力強；(3)適用于工業(yè)化生產(chǎn)。由于去甲基萬古霉素和萬古霉素物化性質(zhì)極為接近，因此，作者采用大孔樹脂吸附分離法提取發(fā)酵液中的去甲基萬古霉素，并優(yōu)化了相關(guān)的工藝參數(shù)。

1 實驗

1.1 試藥、試劑與儀器

發(fā)酵液，華北制藥新藥公司。

去甲基萬古霉素對照品，SIGMA公司；乙醇、鹽酸、氫氧化鈉均為工業(yè)級；HZ801型、HZ802型、HZ803型、HZ820型、HZ816型樹脂，上海華震公司；NKA型、S-8型樹脂，南開大學化工廠；XAD-16型樹脂，上海羅門哈斯化工公司。

高效液相色譜儀，Waters公司。

1.2 預處理

1.2.1 發(fā)酵液預處理

取發(fā)酵液加2 mol·L-1鹽酸調(diào)pH值至3.5，然后加入一定量的助濾劑過濾，濾液作為上柱液備用。

1.2.2 樹脂的預處理/再生

新(再生)樹脂首先用4 BV工業(yè)酒精浸泡24 h,用純化水洗至無醇味；再用3 BV 2 mol·L-1NaOH溶液攪拌浸泡3 h，用純化水洗至中性；然后用3 BV 2 mol·L-1HCl溶液攪拌浸泡3 h,用純化水洗至中性；再用3 BV 2 mol·L-1NaOH溶液浸泡3 h，用純化水洗至中性，待用。

1.3 吸附條件研究

1.3.1 樹脂的篩選

取已處理好的8種樹脂,分別裝入50 mL樹脂柱(R∶H=1∶5)中,取同一批號的去甲基萬古霉素上柱液，分別在常溫下以1.5 BV·h-1的流速上樣，保證樹脂吸附飽和或過飽和，分別測定飽和吸附量。

式中:V0為濕樹脂體積；c0為上柱液濃度；c1為10%上柱液濃度；V1為當流出液濃度為10%上柱液濃度時的流出液總體積。

1.3.2 動態(tài)吸附實驗

將去甲基萬古霉素上柱液用水稀釋成濃度為0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1、2.2 mg·mL-1、2.8 mg·mL-1的上樣液，以1.5 BV·h-1的流速上樣，考察上樣液濃度對樹脂動態(tài)飽和吸附量的影響。

分別用5%鹽酸或10%的氫氧化鈉將去甲基萬古霉素上柱液 (濃度為2.2 mg·mL-1，pH值為3.5)的pH值調(diào)至3.0、4.0、6.0、7.0、 8.0、9.0、10.0，以1.5 BV·h-1的流速上樣，考察上樣液的pH值對樹脂動態(tài)飽和吸附量的影響。

將pH值為9.0、濃度為2.2 mg·mL-1的去甲基萬古霉素上柱液上HZ816樹脂柱吸附，上樣流速(BV·h-1)分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3和4，考察上樣流速對樹脂動態(tài)飽和吸附量的影響。

1.4 解吸條件研究

選用甲醇、乙醇、丙酮三種溶劑進行靜態(tài)解吸，篩選效果最好的解吸劑。

取一定量的HZ816樹脂濕法裝入100 mL玻璃樹脂柱(R∶H=1∶5)中，通上樣液吸附，當流出液濃度接近上樣液濃度10%時，認為樹脂已吸附飽和并停止上樣，用純化水洗滌樹脂后，然后選用5%乙醇-0.1%鹽酸-水、10%乙醇-0.1%鹽酸-水、15%乙醇-0.1%鹽酸-水、20%乙醇-0.1%鹽酸-水、25%乙酸-0.1%鹽酸-水解吸，解吸流速控制在100 mL·h-1，合并高濃度的解吸液，并以HPLC檢測流出液濃度。

1.5 HPLC色譜條件

色譜條件：色譜柱 Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫為40℃，流動相為乙腈∶0.05 mol·L-1KH2PO4=8∶92(體積比)，流速1.0 mL·min-1；檢測波長280 nm，進樣量20 μL。在該色譜條件下去甲基萬古霉素的保留時間為9.5 min。

稱取27 mg去甲基萬古霉素對照品配制成50 mL水溶液，取對照品溶液20 μL注入色譜儀，按上述色譜條件進行測定，按外標法計算峰面積。本方法測得去甲基萬古霉素平均回收率為99.8%(n=5)，RSD=0.15%；精密度為99.88%(n=5)，RSD=0.20%。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂篩選結(jié)果

實驗中測得8種大孔樹脂的飽和吸附量，結(jié)果見表1。

表1 8種大孔樹脂的飽和吸附量

從表1可見，HZ816樹脂的飽和吸附量最高。因此，選取HZ816型樹脂作為去甲基萬古霉素的吸附樹脂。

2.2 吸附條件對HZ816樹脂動態(tài)飽和吸附量的影響

2.2.1 上樣液濃度(圖2)

圖2 上樣液濃度對HZ816樹脂動態(tài)飽和吸附量的影響

由圖2可以看出，去甲基萬古霉素濃度對HZ816樹脂動態(tài)飽和吸附量有一定的影響。當上樣液濃度較低(如0.8 mg·mL-1)時，樹脂動態(tài)飽和吸附量較低，這說明仍有部分樹脂未參與吸附過程，樹脂使用率不高；當上樣液濃度為2.2 mg·mL-1時，樹脂動態(tài)飽和吸附量最高；而當上樣液濃度過高時，樹脂動態(tài)飽和吸附量也稍有下降，這可能是由于一些雜質(zhì)與萬古霉素競爭吸附，從而影響了樹脂對萬古霉素的吸附。選擇較適上樣液濃度為2.2 mg·mL-1。

2.2.2 上樣液pH值(圖3)

圖3 上樣液pH值對HZ816樹脂動態(tài)飽和吸附量的影響

由圖3可以看出，上樣液pH值為9.0時，HZ816樹脂對去甲基萬古霉素的動態(tài)飽和吸附量較高。這可能是由于去甲基萬古霉素呈弱堿性，在弱堿性條件下能夠保持分子狀態(tài)，較易被吸附。因此，選擇較適上樣液pH值為9.0。

2.2.3 上樣流速(圖4)

圖4 上樣流速對HZ816樹脂動態(tài)飽和吸附量的影響

由圖4可以看出,當上樣流速超過2.5 BV·h-1后，樹脂動態(tài)飽和吸附量逐漸下降。流速越慢,吸附越好；但流速過慢會延長生產(chǎn)周期,提高成本。因此，選擇較適的上樣流速為2 BV·h-1。

2.3 解吸條件的確定

2.3.1 解吸溶劑的選擇

解吸實驗結(jié)果表明,乙醇和甲醇均具有較好的解吸能力,因乙醇毒性遠遠低于甲醇,故選用乙醇作為吸附樹脂的解吸溶劑。

2.3.2 解吸劑的確定(表2)

表2 解吸實驗結(jié)果

由表2可知，用較低含量乙醇解吸時解吸拖尾嚴重，解吸率低，這可能是由于有機溶媒含量低時，一方面樹脂的溶脹度不夠，去甲基萬古霉素從內(nèi)孔的溶出受阻，另一方面流動相對去甲基萬古霉素的溶解度低，致使其難以進入流動相而滯留于樹脂；隨著乙醇含量的上升，解吸率明顯增加，所需解吸液體積減少。用15%乙醇-0.1%鹽酸-水解吸時,解吸液甲基萬古霉素的色譜純度最高，表明此時的雜質(zhì)最少。綜合考慮解吸率和解吸液色譜純度，選取15%乙醇-0.1%鹽酸-水作為解吸劑。

2.4 工藝驗證

本工藝經(jīng)過5批中試放大，結(jié)果表明：大孔吸附樹脂HZ816可以很好地提取分離去甲基萬古霉素，動態(tài)飽和吸附量達36.1 mg·mL-1，可將發(fā)酵液中去甲基萬古霉素濃度富集15倍左右；純化水洗樹脂柱后，采用15%乙醇-0.1%鹽酸-水溶液對樹脂柱解吸，解吸液去甲基萬古霉素較集中，基本不拖尾，平均解吸率92.0%；去甲基萬古霉素色譜純度由發(fā)酵液的低于20%提高到解吸液的85.0%，表明發(fā)酵液中大量色素、蛋白、多糖等雜質(zhì)得以有效去除，為后續(xù)進一步純化精制打下了良好的基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

選擇HZ816型樹脂為去甲基萬古霉素的吸附樹脂，在上樣液濃度為2.2 mg·mL-1、pH值為9.0、上樣流速為2 BV·h-1的最佳吸附條件下，HZ816型樹脂對去甲基萬古霉素的吸附量達36.1 mg·mL-1；采用15%乙醇-0.1%鹽酸-水即可將吸附在樹脂柱上的去甲基萬古霉素有效解吸，解吸率達92.0%。該工藝簡單、易操作，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻：

[1] 金有豫.藥理學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2001：333-335.

[2] 陳代杰,李繼安,鄒韻華，等.萬古霉素的研究開發(fā)[J].中國抗生素雜志,2004,29(1):8-10.

[3] 哈羅德·蒙·卡特,哈羅德·伯納德·海斯.改進的萬古霉素沉淀法[P].CN 10 212 280 C,1993-06-16.

[4] Grahek Rok,Bastarda Andrej.Chromatographic purification of va-ncomycin hydrochloride by use of preparative HPLC[P].USP 5 854 390 A,1998-12-29.

[5] 郭立安,朱寶泉,陳代杰.萬古霉素的磁性親和吸附分離[J].生物工程學報,2001,17(5):584-586.

[6] 張巧,張奇,楊藝虹.雙水相萃取技術(shù)應(yīng)用在醫(yī)藥工業(yè)中的展望[J].醫(yī)藥工程設(shè)計雜志,2001,22(5):22-26.

[7] 段金友,方積年.反膠束萃取分離生物分子及相關(guān)領(lǐng)域的研究進展[J].分析化學,2002,30(3):365-371.

[8] Pflaum Zlatko,Turkalj Kobert.Combined process for the purification of vancomycin hydrochloride[P].USP 5 853 720 A,1998-12-29.