C57 BL/6 小鼠腸道線蟲的分離與鑒定

孔垂民,張 燦,李軍偉,劉文華

(青島農業大學動物醫學院,山東 青島 266109)

實驗動物對于生命科學研究和生物技術的發展發揮著不可替代的作用,其健康程度關系到試驗成果的科學性。實驗小鼠作為實驗動物的重要組成部分,寄生蟲感染一直是影響實驗小鼠健康及實驗效果的主要病原體之一。并且某些寄生蟲疾病屬于人獸共患病,嚴重威脅研究人員及養殖人員的身體健康,所以對小鼠腸道寄生蟲病進行及時診斷意義重大。

四翼無刺線蟲(Aspiculuris tetraptera)和隱匿管狀線蟲(Syphacia obvelata)同屬尖尾目、尖尾科、土源性寄生蟲,是小鼠常見的腸道寄生蟲,同為人獸共患寄生蟲[1]。兩種線蟲生活史均為直接發育型,多宿主寄生蟲,在實驗小鼠的腸道中常見,多混合感染。也有關于人感染此兩種線蟲的報道[2]。小鼠嚴重感染兩種線蟲時,會導致腸道功能紊亂,影響增重,生理生化指標發生改變,影響動物試驗結果。

2017 年10 月,某實驗動物養殖場送檢20 只C57BL/6 小鼠,小鼠被毛粗亂無光澤、消瘦、食欲減退、聚堆,反應遲鈍。經詢問養殖人員了解到,發病場房養殖密度100 只/m2,小鼠大范圍出現上述臨床癥狀,嚴重生長發育不良,體重不達標,但小鼠無大范圍死亡現象。經抗生素治療,無明顯效果。送實驗室檢測,懷疑寄生蟲感染,對糞便進行檢查,剖檢小鼠,通過顯微鏡對發現的蟲卵及蟲體進行了初步的形態學鑒定,然后提取DNA,進行18S rDNA 基因片段的擴增和序列分析,診斷結果表明,送檢的小鼠均感染S.obvelata和A.tetraptera,具體過程報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物來源及主要試劑 某實驗動物養殖場送檢的C57BL/6 小鼠20 只。DNA 裂解液及PCR 試劑購自TaKaRa 公司。

1.2 蟲卵觀察 收集C57BL/6 小鼠的新鮮糞便,飽和鹽水漂浮法分離糞便中的蟲卵,顯微鏡下觀察蟲卵形態。

1.3 小鼠腸道病變觀察及蟲體鏡檢 對小鼠禁食24 h 后,脫頸處死,消毒后剖檢,觀察各臟器病變,分別對小鼠的十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結腸進行分段剖檢,將剖檢后的腸道及其內容物一同放入盛有生理鹽水的玻璃平皿中,用異物針挑取蟲體,顯微鏡下觀察蟲體形態。

1.4 18S rDNA 基因的擴增及序列分析

1.4.1 蟲體基因組DNA 的提取 根據寄生蟲鏡檢情況,挑取外部形態相同的10～15 條蟲體到PBS中,吹打洗滌3 次后,置于1.5 mL 離心管中,加入100 μL DNA 裂解液,按照DNAiso Reagent 說明書分別提取2 種線蟲的基因組DNA,于-20 ℃冰箱保存備用。

1.4.2 18S rDNA 基因的PCR 擴增及序列分析以提取的2 種線蟲的DNA 為模板,Vandergast 等[3]使用的18S-5F/18S-9R 為引物,分別對兩種線蟲的18S rDNA 基因進行PCR 擴增。將PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,與預期片段大小一致的PCR產物送往上海派森諾生物股份有限公司進行測序。測序結果與NCBI 網站核酸數據庫進行Blast 比對,比對結果用MEGA7 進行遺傳進化關系分析。

2 結果

2.1 糞便中蟲卵的分離與鑒定 應用飽和鹽水漂浮法檢查C57BL/6 小鼠糞便,小鼠糞便中發現了兩種形態的蟲卵。其一,蟲卵大小(116～130)μm×(28～38)μm,卵殼薄,兩側不對稱,一側較平直,一側圓凸,似半月狀(圖1A)。其二,蟲卵大小(87.5～90)μm×(34.5～41)μm,橢圓形,卵殼薄(圖1B)。根據蟲卵的形態,可確定小鼠至少感染兩種寄生蟲。

圖1 兩種蟲卵的鏡檢形態

2.2 C57BL/6 小鼠腸道剖檢觀察 C57BL/6 小鼠剖解后,在盲腸和結腸發現感染程度不同的寄生蟲,蟲體數量因個體而異,嚴重者腸道中充滿寄生蟲,可見腸道出血,其他臟器未見明顯病變。

2.3 疑似隱匿管狀線蟲形態學觀察 小鼠盲腸發現的蟲體均呈白色,線狀,雌蟲長3～5 mm(圖2A)。成熟的雌蟲,子宮內充滿蟲卵,口孔有唇瓣環繞,頭泡發達程度存在個體差異,有一圓柱狀食道,食道后連有發達的圓形食管球,陰門位于蟲體的前1/6～1/5處(圖2B)。未成熟雌蟲觀察,可清晰地看到子宮呈八字懸浮在腹腔后部(圖2C)。雄蟲蟲體1～1.4 mm,泄殖孔后蟲體急劇變細,尾尖細長。上述蟲體與蟲卵特征,初步判定為隱匿管狀線蟲。

圖2 隱匿管狀線蟲的鏡檢形態

2.4 疑似四翼無刺線蟲的形態學觀察 在小鼠結腸發現的蟲體均呈白色,線狀,雌蟲長2.5～4 mm(圖3A)。口孔周圍有3 片唇瓣環繞,有半橢圓形頭泡,發達的寬頸翼,頸翼的起始位置為頭泡中部,終止位置存在個體差異,多終止于食管球中部。有一棒狀食道,食管球呈扁橢圓形(圖3B)。陰門位于蟲體的前1/3～1/2 處,可見U 形陰道(圖3C)。成熟蟲體,子宮中從陰門到腸道末段都充滿蟲卵,尾部呈圓錐形。雄蟲體長略小于雌蟲,頭部與雌蟲相似,尾部向腹部彎曲,可見寬尾翼,尾根呈圓錐形,無交合刺(圖3D)。根據蟲卵及蟲體形態,可初步判斷為四翼無刺線蟲。

2.5 兩種線蟲的18S rDNA 基因片段的PCR 擴增結果 以通用引物對提取的兩種寄生蟲基因進行18S rDNA 基因的擴增,PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳,結果如圖4 所示。由圖4 可知,條帶大小為850 bp 左右,與預期目的條帶大小一致。

圖3 四翼無刺線蟲的鏡檢形態

圖4 18S rDNA 基因PCR 擴增

2.6 18S rDNA 的測序比對分析 測序獲得的2種18S rDNA 序列提交到NCBI 核酸數據庫中,進行Blast 比對,結果表明擴增得到的基因序列分別與隱匿管狀線蟲和四翼無刺線蟲的同源性達99%。

2.7 兩種寄生蟲的18S rDNA 遺傳進化分析下載與兩種線蟲同源性較高的基因序列,使用MEGA7 軟件制作遺傳進化樹(圖5)。結果表明,分離的四翼無刺線蟲與GenBank 登錄號EF464551.1 的四翼無刺線蟲同源性最高,隱匿管狀線蟲與GenBank 登錄號EF464554.1 的隱匿管狀線蟲同源性最高。

圖5 隱匿管狀線蟲和四翼無刺線蟲的18S rDNA 序列進化樹

3 討論

線蟲蟲體、蟲卵的大小、頭部結構、食管球、尾部的形態特征以及外生殖器官的位置,經常被作為線蟲的分類依據[4]。但寄生蟲種類繁多,同一種線蟲的發育狀況存在著個體差異,部分蟲卵的形態大小比較相近,所以有時僅依靠形態學鑒定難以做出準確判斷。隨著分子生物學的飛速發展,DNA 探針技術、PCR 技術等分子生物學技術廣泛應用于寄生蟲診斷中,不但提高了檢測效率,而且可從基因水平上對寄生蟲進行種屬親緣性鑒定和進化分析。18S rDNA 作為真核生物基因組的保守基因,已經廣泛用于寄生蟲的分類鑒定,是寄生蟲學形態鑒定的重要補充。徐芬[5]利用18S rDNA 基因序列對索科線蟲進行了系統發育分析。Sharmal 等[6]利用18S rDNA 的ITS 序列,對膜殼屬的絳蟲進行了鑒定。本試驗利用18S rDNA 基因序列成功對兩種線蟲做出診斷。但Leblance 等[7]利用18S rDNA 的通用引物對蟯蟲進行檢測時,由于環境污染導致出現了假陽性結果。所以只有分子生物學和形態學觀察兩種方法相互結合驗證,才能確保診斷的準確率。

本試驗對患病小鼠的腸道進行了分段剖檢,僅在盲腸段檢出隱匿管狀線蟲,在結腸段檢出四翼無刺線蟲,說明此類寄生蟲的寄生部位具有專一性,與之前報道一致。對分離到的兩種線蟲進行遺傳進化分析,發現與本試驗分離到的兩種線蟲同源性最高的隱匿管狀線蟲和四翼無刺線蟲是在2007 年美國的小鼠中分離出的,說明兩種線蟲分布廣泛,無地域分布特征。

兩種線蟲同為土源性寄生蟲,發育周期短,感染20 d 左右,宿主糞便中可見蟲卵。蟲卵可在外界直接發育成感染期病原體,病原傳播不需要中間宿主,一旦有小鼠感染,會迅速在群體中傳播。此類寄生蟲一旦感染,很難杜絕重復感染,所以對于寄生蟲病的預防,一定要保持飼養室內外整潔無灰塵,嚴防飲水、飲食及墊料的污染及野鼠的出沒。籠具、食具和出入廠區的人員要及時消毒,堅持每月小消毒,每季大消毒,規范養殖方式。鑒于該場房的感染情況,建議養殖場淘汰小鼠,更換墊料和飼料,降低飼養密度,對場區進行全面消毒后重新引種。