兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗臨床免疫效力試驗

范志宇,王 芳,胡 波,魏后軍,薛家賓,姜 平

(1.南京農業大學動物醫學院,江蘇 南京210095;2.江蘇省農業科學院獸醫研究所 農業部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室 國家獸用生物制品工程技術研究中心,江蘇 南京 210014)

兔出血癥,俗稱兔瘟,于1984 年首次在江蘇無錫等地發現,之后迅速蔓延至全國各地。當前,世界許多國家和地區均有該病的流行和暴發,給全球養兔業造成了巨大的經濟損失[1-3]。目前,對兔瘟的預防,國內、外主要用組織滅活疫苗,由于制作組織滅活疫苗的不免疫兔瘟相關疫苗的家兔數量有限,因此疫苗抗原的來源比較缺乏,造成國內兔瘟疫苗供不應求的局面[4]。

本研究對南京天邦生物科技有限公司中試生產的3 批次兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗(BAC-VP60 株)在6 家臨床試驗兔場開展疫苗免疫期試驗等相關研究工作,完成了該疫苗臨床免疫效力評估,為該疫苗的新獸藥注冊申報奠定了基礎。

1 材料

1.1 疫苗 3 批次經安全檢驗、效力檢驗等項目檢驗合格的兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗(BAC-VP60 株)中試產品(批號分別為：2013002、2013003、2013004),南京天邦生物科技有限公司中試生產;兔病毒性出血癥滅活疫苗(批號：129083),南京天邦生物科技有限公司生產,2 ℃～8 ℃保存備用。

1.2 攻毒毒種 兔出血癥病毒皖阜株肝毒(病毒含量≥105.5LD50/mL,或HA 效價不低于1∶256),由江蘇省農業科學院獸醫研究所分離、鑒定、凍干保存。

1.3 臨床試驗動物 不同品種：獺兔、肉兔、毛兔,不同日齡：35～42 日齡幼兔、2 月齡健康家兔,分別來自江蘇A 兔場、江蘇B 兔場、江蘇C 兔場、山東A 兔場、浙江A 兔場、浙江B 兔場共6 家養殖場。

2 試驗方法

2.1 玻片法血凝試驗[5]取少量待檢兔肝臟樣品,置于清潔的載玻片,用剪刀將肝臟樣品剪碎,滴加2 滴～3 滴1%人“O”型紅細胞于肝臟樣品上,同時設立兔出血癥陰、陽性肝臟對照,輕輕混勻后,于玻片上孵育2 min,若有兔病毒性出血癥病毒,肉眼可直接觀察到玻片出現凝集現象。

2.2 臨床試驗實驗動物選擇 6 家臨床試驗兔場兔群必須精神狀態健康,食欲、飲欲正常,實驗兔未發生兔病毒性出血癥,無兔病毒性出血癥臨床癥狀,無其他傳染病,未接種過針對兔病毒性出血癥的單苗或聯苗。所有受試兔包括對照兔(哨兵兔)在開始試驗后不再接種針對兔病毒性出血癥的其他單苗或聯苗,直至試驗結束。

在江蘇A 兔場、山東A 兔場、江蘇B 兔場進行肉兔試驗,分別在3 家試驗兔場選擇35～42 日齡幼兔、2 月齡健康家兔,備用;在浙江A 兔場、浙江B 兔場進行獺兔試驗,分別在2 家試驗兔場選擇35～42日齡幼兔、2 月齡健康家兔,備用;在江蘇C 兔場進行毛兔試驗,選擇35～42 日齡幼兔、2 月齡健康家兔,備用。

2.3 動物分組和免疫 使用批號2013002 疫苗分別在江蘇A 兔場、浙江A 兔場、江蘇C 兔場和浙江B 兔場進行免疫,使用批號2013003 疫苗在山東A兔場進行免疫,使用批號2013004 疫苗在江蘇B 兔場進行免疫;使用批號129083 分別在6 家兔場免疫35～42 日齡幼兔和2 月齡健康兔;同時有一定數量的不同日齡家兔留作對照兔,皮下注射滅菌生理鹽水,不接種疫苗。

2.4 臨床效力試驗 臨床效力試驗過程中對死亡兔進行剖檢,如有疑似兔出血癥癥狀死亡兔要帶回實驗室進行檢測,參照中華人民共和國農業行業標準進行病毒檢測,確定是否死于兔出血癥。

2.5 抽檢攻毒試驗 分別在注射后第150、210 天分別在6 家試驗兔場隨機選擇中試產品和同類疫苗免疫幼兔和仔兔包括對照兔,5 只/組/批/次,帶回實驗室,采用攻毒法進行效力檢驗,各皮下注射兔出血癥病毒皖阜株肝毒1 mL,連續觀察7 日,記錄死亡與保護的動物數量,對死亡兔進行剖檢觀察并取肝臟進行人“O”型紅細胞凝集試驗。

2.6 血清抗體測定 對6 家臨床試驗兔場1 mL/只免疫的2 月齡兔,每家兔場隨機選擇10 只,免疫后每隔30 日進行1 次血液采集,帶回實驗室分離血清,-20 ℃凍存備檢,連續采集7 個月。使用實驗室建立的血凝抑制(HI)方法和ELISA 方法進行抗體檢測,并進行統計分析。

3 結果

3.1 臨床效力試驗 兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗(BAC-VP60 株)中試產品相繼在江蘇A 兔場、江蘇B 兔場、江蘇C 兔場、山東A 兔場、浙江A兔場、浙江B 兔場共6 家養殖場進行中試免疫試驗,共使用中試產品疫苗免疫家兔29 565 只,其中幼兔24 313 只、2 月齡兔1 820 只、仔兔1 607 只、孕兔1 225 只;使用兔病毒性出血癥滅活疫苗免疫家兔2 400 只,其中幼兔1 200 只,2 月齡兔1 200 只;設立未免疫對照兔(崗哨兔)360 只,其中肉兔120只、獺兔180 只,毛兔60 只;以上所有家兔在試驗期間均沒有發生兔出血癥,6 家兔場中試疫苗免疫組、同類疫苗免疫組和對照組出欄率差異不明顯。說明兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗中試產品可以保護免疫兔場不發生兔出血癥。

3.2 抽檢攻毒試驗 中試產品和同類產品分別免疫后第150、210 天攻毒,攻毒后進行觀察,如果攻毒兔出現以下癥狀為疑似兔出血癥,需用玻片法進行凝集試驗確診。攻毒兔死前表現短暫的興奮,突然倒地,劃動四肢呈游泳狀,瀕死時抽搐,角弓反張,眼球突出,慘叫幾聲而死,典型病例可見鼻孔流出血樣液體,肛門松弛,肛周有少量淡黃色黏液附著。剖檢可見肺有不同程度充血、瘀血;肝臟淤血、腫大、質脆,表面呈淡黃色或灰白色條紋,切面粗糙;脾臟淤血、腫大,呈藍紫色;腎臟和胸腺水腫、腫大,并有散在性針尖至粟粒大出血點(見中插彩版圖1)。

圖1 典型兔出血癥癥狀和剖檢病變

如出現兔出血癥典型的病理變化,對死亡兔肝臟懸液作人“O”型紅細胞凝集試驗進行確診。結果顯示,玻片凝集試驗結果均為陽性,死亡兔均為兔出血癥特異性死亡(見中插彩版圖2)。

圖2 玻片凝集試驗

使用同一批次(批號2013002)中試產品或同類疫苗免疫肉兔、獺兔、毛兔的免疫期攻毒效力檢驗,結果顯示,同批次疫苗對不同品種家兔均可以產生7 個月的保護;使用不同批次(批號2013002、2013003、2013004)中試產品或同類疫苗免疫肉兔進行免疫期攻毒,免疫兔均健活,對照兔至少死亡4只,說明不同批次疫苗對同一品種也可以產生7 個月的保護。結果說明,兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗的免疫期為7 個月。見表2。

表1 臨床效力試驗統計結果

表2 抽檢攻毒試驗結果

3.3 血清抗體測定 對6 家臨床試驗兔場1 mL/只免疫的2 月齡兔,將免疫后7 個月內每月采集的血清用血凝抑制(HI)方法和ELISA 方法進行抗體檢測,并進行統計分析(見中插彩版圖3 和圖4)。結果顯示,免疫后1 個月,家兔血清抗體HI 效價達到1∶23.13,免疫后3 個月,家兔血清抗體HI 效價達到高峰,此后逐漸下降,注射疫苗后7 個月其血清中平均抗體水平仍維持在1∶23以上,對照組家兔血清抗體平均HI 效價在1∶2～1∶20.4之間。不同批次疫苗免疫兔和同批次疫苗免疫肉兔血清抗體HI 效價沒有顯著差異。薛家賓等研究結果也顯示[6],家兔血清抗體HI 效價達到1∶23及以上時,可以100%抵抗RHDV 強毒攻擊。本試驗抗體測定結果說明,兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗可以產生7 個月的保護。

圖3 不同批次疫苗肉兔免疫持續期血清HI 效價

圖4 同批次疫苗不同品種家兔免疫持續期血清HI 效價

對臨床試驗兔場1 mL/只免疫的2 月齡兔,將免疫后7 個月內每月采集的血清用ELISA 方法進行抗體檢測,并進行統計分析(中插彩版圖5 和圖6)。結果顯示,免疫后1 個月,家兔免疫組血清ELISA 方法OD450nm平均值達到0.800 2,與當月對照組血清ELISA 方法OD450nm平均值0.168 5 有顯著差異;免疫后4 個月,家兔血清ELISA 方法OD450nm平均值達到高峰,免疫組ELISA 方法OD450nm平均值為1.081 2,對照組血清ELISA 方法OD450nm平均值為0.125 1;此后3 個月變化不明顯,注射疫苗后7 個月其血清ELISA 方法OD450nm平均值仍維持在1.038 8,對照組家兔所有血清ELISA方法OD450nm平均值為0.160 9,與免疫組有顯著差異。不同批次疫苗免疫兔和同批次疫苗免疫肉兔家兔血清ELISA 方法OD450nm平均值沒有明顯差異。

圖5 不同批次疫苗肉兔免疫持續期血清ELISA 值

圖6 同批次疫苗不同品種家兔免疫持續期血清ELISA 值

4 討論

由于市售兔病毒性出血癥滅活疫苗存在種種缺點,研究人員對兔出血癥疫苗的研究逐步轉向既有保護作用,同時沒有生物安全隱患的基因工程疫苗。近年來,國內外開展了大量的相關研究,試驗證明RHDV 的主要結構蛋白VP60 能在多種載體系統中表達,并可以形成與天然RHDV 病毒粒子免疫原性無任何差異的病毒樣顆粒[7-9]。王芳等通過分子生物學技術使兔出血癥病毒衣殼蛋白基因在桿狀病毒系統表達,試驗證明所表達的衣殼蛋白具有良好的免疫原性[10]。宋艷華等應用VP60-ELISA 方法測定RHDV 特異性抗體,結果顯示RHDV-VP60 疫苗免疫后VP60 特異性抗體可以在高水平維持240 d[11]。

本研究制備的兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗(BAC-VP60 株)在6 家臨床試驗兔場免疫健康家兔,免疫期間沒有發生兔出血癥;免疫持續期抽檢用致死劑量的兔出血癥病毒攻擊保護率都可以達100%,結果顯示,疫苗對肉兔、獺兔、毛兔免疫期均可以達到7 個月。以上結果表明,兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗(BAC-VP60 株)臨床效力檢驗合格,免疫期為7 個月,也進一步證明了國內外學者的研究報道[12]。兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗(BAC-VP60 株)于2017 年2 月獲得國家一類新獸藥注冊證書([2017]新獸藥證字06 號),該疫苗將替代兔病毒性出血癥滅活疫苗,在兔瘟的免疫防控中起到重要作用,從而促進我國家兔疾病防控事業的健康、持續、穩定發展。