小鼠諾如病毒巢式PCR 檢測方法的建立及應用

趙 娜,王麗媛,趙歆伊,曹福源,陳 松,張艷淑,姚 林,李 爽

(1.華北理工大學實驗動物中心,河北 唐山063210;2.華北理工大學公共衛生學院,河北 唐山 063210;3.華北理工大學基礎醫學院,河北 唐山 063210)

小鼠諾如病毒(Murine norovirus,MNV)是一種引起免疫缺陷小鼠腦炎、腦膜炎、肝炎、腸和肺炎的與人類諾如病毒密切相關的傳染性病原[1]。該病毒于2003 年從轉導蛋白和轉錄激活因子1(STAT1)以及重組體激活基因2(RAG2)缺陷(RAG2-/-/STAT1-/-)小鼠中被首次發現[2],之后美國、加拿大、日本、韓國等國的實驗小鼠體內均監測到該病毒[3-5],并發現MNV 是感染實驗動物的重要病原體,幾乎所有的實驗小鼠對此病毒易感。目前MNV的診斷方法主要為分子生物學和血清學方法。RT-PCR 已廣泛應用于諾如病毒的檢測,成為諾如病毒診斷的金標準,但由于杯狀病毒科基因組高度變異性,其敏感性及特異性受到一定影響。為了設計一種高敏感性和特異性的檢測方法,突破目前MNV 檢測局限,本研究通過代表性毒株序列比對,選取MNV 的保守區序列,建立MNV 巢式PCR 檢測方法,為MNV 感染的分子生物學診斷提供了一種快速、敏感的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒 感染小鼠諾如病毒、呼腸孤病毒III 型(Reovirus type III)、小鼠輪狀病毒(Mouse rotavirus)、小鼠細小病毒(Minute virus of mice)、小鼠微小病毒(Mouse parvovirus),小鼠腺病毒(Mouse adenovirus)病料,均由華北理工大學實驗動物中心實驗室檢測并保存。

1.2 主要試劑 ExTaqDNA 聚合酶、反轉錄酶(M-MLV)、Olig dT,購自寶生物工程(大連)有限公司;TRIZol Reagent RNA 提取試劑盒,購自Invitrogen公司;DNA Marker、凝膠回收試劑盒,購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 引物的設計與合成 根據已發表的MNV 基因組序列(KF113527、EF014462、HQ317203、EU004670、DQ223041、DQ223042、JX048594),選取MNV 保守區序列設計引物,利用Oligo 6.0 生物學軟件設計合成了2 對引物,由北京諾賽生物工程有限公司合成。第1 輪擴增引物P1：5′-GAGGATGAGTGATGGCGC-3′(5058～5075 bp);P2：5′-TTGAGGGAAGGGATGGGT-3′(5836～5819 bp);第2 輪擴增引物P3：5′-GGTGGTTGTTGCCCTTGT-3′(5418～5435 bp);P4：5′-GGCTGTTTGTGCGGAGTG-3′(5635～5618 bp)。

1.4 病毒RNA 提取和cDNA 合成 按TRIZol Reagents 試劑盒操作說明書提取病毒總RNA,然后進行反轉錄。反轉錄體系20 μL,總RNA 2 μL,5×Reverse transcriptase Buffer 4 μL,dNTP(2.5 mmol/L)8 μL。RNA 抑制劑0.5 μL,隨機引物(9 mer)50 pmol,M-MLV 1 μL,DEPC 水補足20 μL。反轉錄反應條件為30 ℃10 min,42 ℃1 h,99 ℃5 min,4 ℃10 min,即合成cDNA 第一鏈。

1.5 巢式PCR 反應的建立 巢式PCR 需進行2 次PCR 反應。PCR 反應體系為50 μL,包括10×ExTaqBuffer 5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)4 μL,上游引物和下游引物(100 pmol/μL)各1 μL,ExTaq酶5 μL,病毒cDNA 第一鏈1 μL,ddH2O 補足50 μL。第1 次PCR 反應所用引物為MNV P1 和MNV P2,擴增程序如下：98 ℃預變性5 min,94 ℃變性45 s,46 ℃退火45 s,72 ℃延伸70 s,30 個循環,再72 ℃延伸10 min,4 ℃終止反應。巢式PCR 使用引物MNV P3 和Flay P4,擴增程序為：98 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個循環,再72 ℃延伸10 min,4 ℃終止反應。2 次PCR 后進行濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳,結果在紫外光下進行分析。

1.6 序列分析 回收擴增產物,送測序公司進行測序。利用Clustal W 和Mega 6.0,將測序序列與諾如病毒代表毒株序列進行核苷酸同源性分析,驗證產物的特異性。

1.7 巢式PCR 敏感性試驗 使用分光光度計測量MNV 核酸濃度,并換算成拷貝數。用蒸餾水10 倍稀釋核酸至1×100個拷貝/μL,從1×107個拷貝/μL 開始每個稀釋度取1 μL 為模板,分別采用巢式PCR 和普通PCR 進行檢測。

1.8 巢式PCR 特異性試驗 分別提取陽性病料中呼腸孤病毒III 型、小鼠輪狀病毒的RNA 和小鼠細小病毒、小鼠腺病毒的DNA,用1.5 中建立的巢式PCR體系進行擴增,以檢驗體系的特異性。

1.9 巢式PCR 對臨床樣品的檢測 采集野生小鼠的盲腸及其內容物加入10 倍PBS(pH 值7.2)進行研磨制成勻漿,凍融3 次,8 000 r/min 離心10 min,取上清按TRIZol Reagents(Invitrogen)試劑盒操作說明書提取病毒總RNA,反轉錄后用已建立的巢式PCR 進行檢測。

2 結果與分析

2.1 擴增產物的檢測及鑒定 擴增產物的檢測PCR 擴增產物經過10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳,第1輪擴增產物在779 bp、第2 輪擴增產物在218 bp處可見特異性DNA 擴增條帶(圖1),與預期大小相符。

圖1 巢式PCR 擴增結果

2.2 序列分析 將以MNV P3 和P4 為引物的PCR產物進行測序,結果表明6 個樣品序列均為小鼠諾如病毒基因序列。將MNV 基因測序序列與Gen-Bank 公布的其他MNV 代表株相同位置基因進行序列比結果顯示,與毒株BJ 10-2062(KM458057)相似性最高,同源性為98.8%。

2.3 巢式PCR 的敏感性 巢式PCR 的檢測極限為500 個拷貝/μL,而傳統PCR 的有效擴增最小量為5×105個拷貝/μL。巢式PCR 的敏感性為普通PCR的1 000 倍(圖2)。

2.4 巢式PCR 的特異性 應用建立的巢式PCR 反應體系對MNV 和其他對照病原在相同條件下進行擴增以檢驗體系的特異性。結果顯示,MNV 巢式PCR 擴增片段大小為779 bp 和218 bp,與預計相符,而其他對照病原均沒有條帶出現(圖3)。

圖2 巢式PCR 敏感性檢測

圖3 巢式PCR 特異性檢測

2.5 巢式PCR 對臨床樣品的檢測 提取30 份樣品的核酸,用建立的巢式PCR 體系進行檢測,其中17 份為陽性。陽性產物經測序后均為MNV 病毒片斷序列,陽性率為56.67%。

3 討論

自2003 年首次分離到小鼠諾如病毒以來,學者發現MNV 具有多種亞型,且核酸與人諾如病毒同樣具有高度變異性。應用分子生物學技術對其進行檢測,引物的廣譜性對于檢測的敏感、特異性非常關鍵[6]。基于小鼠諾如病毒與人類諾如病毒序列的分析,引物設計位點大多為具有一定保守性的非結構蛋白編碼序列作為檢測目的片段。隨著MNV 全基因組序列的測定和分析,發現在MNV的5′端和ORF1-ORF2 連接位置分別存在32 bp和64 bp 的保守序列。之后,在ORF4 和3′非編碼區也同樣發現存在47 bp 和83 bp 的保守序列區,這些保守序列為PCR 診斷方法的建立奠定基礎[7]。本試驗所用設計的引物均是針對這一區域進行擴增,所采用的引物經前人研究驗證對不同亞型的MNV 均具有較為理想的檢出率。試驗建立巢式PCR 方法相對于傳統的方法靈敏度更高,特異性好,操作簡單,而且該方法能檢測出病毒載量很低或處于潛伏期的病毒。小鼠諾如病毒巢式PCR 方法的建立有助于發現和隔離病毒攜帶動物,為進一步研制MNV 巢式PCR 檢測試劑盒奠定基礎。

流行病學調查表明,MNV 在世界范圍內廣泛傳播。2011 年有學者對歐洲實驗小鼠MNV 感染情況進行檢測,發現MNV 感染率高達58%～64%[8]。2012 年,日本報道野生嚙齒類動物中MNV 感染率為14.9%,感染動物中85.4% 為姬鼠,其余為黑鼠[9]。在我國,袁文等于2010 年首次報道廣東省實驗小鼠攜帶有MNV,用RT-PCR 的方法檢測206份小鼠盲腸內容物,其中MNV 陽性為77 份,陽性率37.38%。各品系小鼠易感性無顯著差異[10]。本試驗對30 份屏障環境內的小鼠樣品進行檢測,發現陽性率56.67%,該結果高于袁文等于2010 年報道的廣東省實驗小鼠MNV 37.38%陽性率,這與巢式PCR 敏感性高于常規RT-PCR 方法有關。目前我國對MNV 的流行病學調查研究較少,亟需進一步了解我國實驗小鼠MNV 感染情況,加強病毒分子流行病學研究,為該病毒在實驗動物飼養管理的防控及分子流行病學研究提供理論基礎和依據。