豬圓環(huán)病毒2 型片狀載體懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)工藝研究

許 冬,曹 鋒,魏 磊,張 路,虞慎義,馮育寧,商 俊

(安徽東方帝維生物制品股份有限公司,安徽 亳州 236800)

豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2)屬于圓環(huán)病毒科,感染PCV2 后導(dǎo)致母豬繁殖障礙、豬增生性和壞死性肺炎、豬皮炎、腎病綜合征(PDNS)、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)以及豬的先天性震顫等疾病。該病毒在全國(guó)各地區(qū)廣泛流行,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的影響和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,現(xiàn)在對(duì)于豬圓環(huán)病毒2 型主要以疫苗預(yù)防為主[1]。目前疫苗生產(chǎn)中,常用PK-15 細(xì)胞增殖PCV2,但由于PCV2 體外增殖能力弱,致使PCV2 抗原含量較低,因此,PCV2 的抗原含量高低已成為制約現(xiàn)有疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵瓶頸之一,大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)核心技術(shù)是提升單位體積內(nèi)PK-15 細(xì)胞的數(shù)量,其中微載體懸浮培養(yǎng)[2-3]、片狀載體懸浮培養(yǎng)、全懸浮培養(yǎng)是當(dāng)前較為成熟的一項(xiàng)大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),在國(guó)內(nèi)外已成功應(yīng)用于獸用疫苗抗原制備,這三種培養(yǎng)技術(shù)具有自動(dòng)化控制程度高、不易污染、易于大規(guī)模生產(chǎn)、抗原產(chǎn)量和含量高等優(yōu)點(diǎn)[4]。片狀載體懸浮培養(yǎng)在單位體積內(nèi)細(xì)胞的數(shù)量要大于微載體懸浮培養(yǎng),因此本研究選擇了片狀載體懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)PCV2 抗原的工藝流程,克服了現(xiàn)有PCV2 滅活疫苗病毒含量低的技術(shù)瓶頸,為大規(guī)模生產(chǎn)疫苗抗原提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒種和細(xì)胞 PK-15 細(xì)胞和豬圓環(huán)病毒2 型毒種(病毒含量106.0TCID50/mL)由安徽東方帝維生物制品股份有限公司自繁、保存。

1.2 主要試驗(yàn)材料 片狀載體(ESCO BioNOC IITM);DMEM 干粉(Gibco 公司);D-氨基葡萄糖(Sigma公司);胰酶(Gibco 公司);新生牛血清(金源康實(shí)業(yè)有限公司);PCV2 單克隆抗體(北京博益通達(dá)科技有限公司);羊抗鼠熒光二抗(東莞寮步畢質(zhì)生物試劑有限公司)。原輔材料經(jīng)檢驗(yàn)均符合要求。

1.3 主要儀器設(shè)備 生物反應(yīng)器,購(gòu)自南京比瑞生物科技有限公司;血糖儀及試紙(羅氏血糖儀);0.22 μm 濾芯、濾殼,購(gòu)自美國(guó)Pall 公司;pH 計(jì),購(gòu)自德國(guó)賽多利斯公司;熒光倒置顯微鏡、倒置顯微鏡,購(gòu)自德國(guó)徠卡公司;轉(zhuǎn)瓶機(jī)、細(xì)胞觀測(cè)臺(tái),購(gòu)自蘭州瀾飛公司;移液器,購(gòu)自德國(guó)艾本德公司。所有儀器設(shè)備經(jīng)過(guò)驗(yàn)證,符合要求。

1.4 培養(yǎng)基生長(zhǎng)液 DMEM 溶液加10%新生牛血清,用7.5% 碳酸氫鈉調(diào)pH 值至7.0;維持液：DMEM 溶液加2%新生牛血清,用7.5%碳酸氫鈉調(diào)pH 值至7.0。

1.5 方法

1.5.1 接毒量及最佳帶毒傳代次數(shù)的確定 按0.5%、1%、3%、5%接毒量,同步接種到PK-15 細(xì)胞懸液中,至15 L 轉(zhuǎn)瓶,37 ℃培養(yǎng)24 h 后加入終濃度為1 mmoL/L 的D-氨基葡萄糖溶液,當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至致密單層后,按照1∶3的比例進(jìn)行帶毒傳代,按此方法進(jìn)行4 次帶毒傳代,觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,每次帶毒傳代前取樣進(jìn)行病毒含量測(cè)定。每個(gè)接毒量帶毒傳代后留2 瓶,病毒含量為2 瓶的混合樣。

1.5.2 片狀載體濃度的確定 選取濃度分別為15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L 的片狀載體,接種濃度為0.5×106的PK-15 細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng),24 h 開(kāi)始第1 次取樣,其后每4 h 取樣1 次,測(cè)定葡萄糖的含量,根據(jù)糖耗情況更換生長(zhǎng)液,直到糖耗穩(wěn)定,觀察不同片狀載體濃度到糖耗穩(wěn)定時(shí)的時(shí)間,然后換維持液,繼續(xù)培養(yǎng),48 h 取樣測(cè)病毒含量,繼續(xù)觀察能維持細(xì)胞的最長(zhǎng)時(shí)間。其他培養(yǎng)條件：pH 值為7.2、DO 為60%、培養(yǎng)溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速50 r/min。

1.5.3 片狀載體懸浮培養(yǎng)接種細(xì)胞濃度確定 設(shè)定0.25×106、0.5×106、0.75×106、1×106個(gè)細(xì)胞/mL 4 個(gè)初始接種密度(含毒),分別接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng),24 h 開(kāi)始取樣,其后每4 h 取樣1次,檢測(cè)葡糖糖含量,當(dāng)葡萄糖含量小于5 mmoL/L時(shí)更換生長(zhǎng)液,直到糖耗穩(wěn)定,換維持液繼續(xù)培養(yǎng)48 h 取樣做TCID50檢測(cè),并繼續(xù)培養(yǎng)觀察細(xì)胞維持最長(zhǎng)時(shí)間。其他培養(yǎng)條件：pH 值為7.2、DO 為60%、培養(yǎng)溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速50 r/min。

1.5.4 最佳收獲時(shí)間確定 將含PCV2 的細(xì)胞懸液接種到片狀載體上懸浮培養(yǎng),24 h 開(kāi)始每4 h 檢測(cè)1 次葡糖糖含量,根據(jù)葡糖糖含量更換生長(zhǎng)液,直到糖耗穩(wěn)定,換維持液繼續(xù)培養(yǎng),在24 h、36 h、48 h、60 h、72 h 取樣做TCID50測(cè)定,連續(xù)做3 批。其他培養(yǎng)條件：pH 值為7.2、DO 為60%、培養(yǎng)溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速50 r/min。

1.5.5 最佳連續(xù)收獲時(shí)間的確定 將含毒的細(xì)胞懸液接種到片狀載體上懸浮培養(yǎng),24 h 開(kāi)始每4 h檢測(cè)一次葡糖糖含量,根據(jù)葡糖糖含量更換生長(zhǎng)液,直到糖耗穩(wěn)定,換維持液繼續(xù)培養(yǎng)48 h 進(jìn)行一收,加入新的維持液繼續(xù)培養(yǎng),在24 h、36 h、48 h 取樣做TCID50測(cè)定并收獲后換維持液,按此方法連續(xù)收獲,直到細(xì)胞脫落,連續(xù)3 批試驗(yàn)。其他培養(yǎng)條件：pH 值為7.2、DO 為60%、培養(yǎng)溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速50 r/min。

2 結(jié)果

2.1 接毒量及最佳帶毒傳代次數(shù) 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1,0.5%和1%接毒量在3 次帶毒傳代后細(xì)胞狀態(tài)良好,第4 次帶毒傳代出現(xiàn)細(xì)胞脫落,3%和5%接毒量在第3 次帶毒傳代后細(xì)胞出現(xiàn)脫落,1%接毒量3 次帶毒傳代后的抗原病毒含量明顯大于0.5%的接毒量,為了上生物反應(yīng)器的細(xì)胞既能生長(zhǎng)良好又能產(chǎn)出高病毒含量,根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果,最佳的接毒量為1%,最佳帶毒傳代次數(shù)為2 次。

2.2 片狀載體濃度 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,片狀載體濃度在15 g/L 和20 g/L 時(shí)細(xì)胞維持時(shí)間比25 g/L 和30 g/L 要長(zhǎng),20 g/L 的片狀載體濃度生產(chǎn)出的抗原病毒含量要高于15 g/L,而20 g/L 的片狀載體濃度生產(chǎn)出的抗原病毒含量比25 g/L 和30 g/L 的略低。綜合考慮,最佳的片狀載體濃度為20 g/L。

2.3 片狀載體接種細(xì)胞濃度 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3,接種每毫升細(xì)胞濃度25 萬(wàn)個(gè)和50 萬(wàn)個(gè)的細(xì)胞維持時(shí)間最長(zhǎng),每毫升50 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞濃度的抗原病毒含量明顯比每毫升25 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞濃度的高,而每毫升50 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞濃度的抗原病毒含量和每毫升75 萬(wàn)個(gè)、100 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞濃度相當(dāng)。綜合考慮,最佳的片狀載體細(xì)胞接種濃度為0.5×106個(gè)細(xì)胞/mL。

表1 接毒量及最佳帶毒傳代次數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

表2 片狀載體濃度試驗(yàn)結(jié)果

表3 片狀載體接種細(xì)胞濃度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 最佳收獲時(shí)間試驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表4,綜合3 批的結(jié)果可知,48 h 的抗原病毒含量明顯高于24 h 和36 h,而48 h 的抗原病毒含量只比60 h 和72 h 的略低。綜合考慮,最佳的收毒時(shí)間為換維持液后48 h。

2.5 最佳連續(xù)收獲時(shí)間 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5,綜合3批6 個(gè)收次的檢驗(yàn)結(jié)果,24 h、36 h、48 h 的抗原病毒含量呈梯度上升且48 h 的抗原病毒含量最高。本次3 批的試驗(yàn),從第5 收開(kāi)始細(xì)胞有少量的脫落,第6 收細(xì)胞脫落明顯,考慮抗原的純凈性,沒(méi)有繼續(xù)培養(yǎng)收獲,從抗原病毒含量的檢驗(yàn)結(jié)果看,第6 收的抗原病毒含量明顯下降,綜合考慮,最佳的連續(xù)換液收獲時(shí)間為48 h,最少可連續(xù)收獲5 次。

表4 最佳收獲時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果

表5 最佳連續(xù)收獲時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果

2.6 試驗(yàn)結(jié)論 利用片狀載體懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)PCV2抗原的最佳生產(chǎn)工藝為：按1%接毒量將PCV2 毒種接種到PK-15 細(xì)胞懸液中,在轉(zhuǎn)瓶上培養(yǎng),并帶毒傳代2 次后,將含毒的細(xì)胞懸液接種到片狀載體上懸浮培養(yǎng),最佳的片狀載體濃度為20 g/L,最佳細(xì)胞接種濃度為0.5×106個(gè)細(xì)胞/mL,培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)糖的消耗情況,進(jìn)行換液,培養(yǎng)72 h 換維持液,每48 h 收獲1 次,可連續(xù)收獲5 次以上,且抗原的病毒含量均大于106.5TCID50/mL,前5 次收獲穩(wěn)定在107.0TCID50/mL。

3 討論

3.1 目前大部分企業(yè)生產(chǎn)PCV2 疫苗都采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng),抗原病毒含量較低、產(chǎn)量小,難以達(dá)到制備全病毒滅活疫苗的要求[5];采用微載體懸浮培養(yǎng)PCV2 抗原很難克服攪拌剪切力導(dǎo)致細(xì)胞脫落的問(wèn)題;全懸浮培養(yǎng)PCV2 抗原的生產(chǎn)工藝,目前只能做到1 次收獲。本研究利用PCV2 在PK-15 細(xì)胞內(nèi)繁殖不產(chǎn)生細(xì)胞病變,且細(xì)胞長(zhǎng)滿后維持時(shí)間長(zhǎng)的特性,制定了本研究的方案,在抗原病毒含量和收獲方式上取得了重大突破,病毒含量比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)的抗原病毒含量高5～10 倍,且采用連續(xù)收獲法,打破了傳統(tǒng)的一次收獲法,提高了抗原產(chǎn)量,收獲上清液,降低了抗原純化的難度。

3.2 目前全病毒的PCV2 滅活疫苗品質(zhì)還有很大的提升空間,比如抗原的精細(xì)純化以及純化的方法、減少副反應(yīng)等等問(wèn)題的研究。近年來(lái),對(duì)PCV2的研究在分子生物學(xué)方面取得了顯著的進(jìn)展,部分企業(yè)研發(fā)的豬圓環(huán)基因工程疫苗在市場(chǎng)上得到了很好的應(yīng)用,比如：勃林格等為昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)的基因工程亞單位疫苗,用PCV2 的ORF2 基因(Cap 蛋白)插入到昆蟲(chóng)桿狀病毒[6],用昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng),獲得重組的PCV2 Cap 蛋白[7],制備亞單位疫苗。而易邦采用PCV2 的ORF2 基因(Cap 蛋白)插入大腸桿菌原核載體中去,利用大腸桿菌表達(dá)PCV2 Cap 蛋白[8],制備亞單位疫苗。普萊柯利用大腸桿菌表達(dá)的Cap 蛋白,然后將5 個(gè)Cap 蛋白組裝成一個(gè)五聚體,再將12 個(gè)五聚體組裝一個(gè)VLP(病毒樣顆粒)[9],比單純的Cap 蛋白免疫原性好。采用基因工程的方法生產(chǎn)出的PCV2 疫苗,純度高,副反應(yīng)很小,成為今后疫苗研究的熱點(diǎn)。