山東地區雞源大腸桿菌中超廣譜β-內酰胺酶和磷霉素耐藥基因的流行性研究

王志浩,顏 碩,王昱瓔,劉寶濤

(青島農業大學動物醫學院,山東 青島 266109)

大腸桿菌(Escherichia coli),是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、埃希菌屬(Escherichia)的代表菌[1]。雞大腸桿菌病是由大腸桿菌(E.coli)中的某些致病性菌株所導致的多種疾病的總稱,多采用抗生素類藥物治療[2]。抗菌藥常在獸醫臨床中疾病的治療、預防與促進生長等方面使用,由于長期使用抗生素,使得動物正常菌群的耐藥率不斷上升[3]。超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)主要產生于大腸桿菌和克雷伯氏菌屬,可水解3 代頭孢菌素和單環酰胺酶類藥物,并被BIA 抑制劑(如舒巴坦)所抑制[4]。ESBLs 根據基因同源性的不同,目前可分為5 類：TEM 型、SHV 型、CTX-M 型、OXA 型和其他類型等[5-6],目前我國主要流行型為CTX-M 型。磷霉素主要用于治療人金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等引起的軟組織感染和單純性尿路感染。Bartoloni[7]等在南美地區分離得到170 株大腸桿菌,其磷霉素耐藥率為98.2%,由于磷霉素在我國臨床應用時間相對國外較短,目前對獸醫領域磷霉素及其耐藥基因流行性的相關報道較少。本研究調查了山東地區雞源大腸桿菌的耐藥情況及ESBLs和磷霉素耐藥基因的攜帶情況,為雞臨床用藥提供科學依據,也為預防和減少耐藥的出現提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集 2015-2016 年在山東青島、臨沂、威海、煙臺、濰坊等各個地區的養殖場、活禽交易市場采集雞泄殖腔拭子336 份。

1.2 主要試劑 細菌生化微量鑒定管,購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司;Taq 酶、Marker,購自TaKaRa 試劑公司;頭孢噻肟(CTX)、頭孢噻呋(CTF)、氨芐西林(AMP)、氟苯尼考(FFL)、多西環素(DOX)、四環素(TET)、慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、鏈霉素(STR)、環丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)、左氧氟沙星(LEV)、萘啶酸(NAL)和磷霉素(FOS)等藥敏試驗藥物,購自上海麥克林試劑公司;麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂、LB 瓊脂和LB 肉湯,購自北京陸橋生物技術有限責任公司。

1.3 細菌的分離鑒定 將樣品接種于LB 肉湯,培養過夜。并接種于麥康凱瓊脂,放入恒溫培養箱中36 ℃±1 ℃培養18～24 h,并進行純化;挑取純化后的可疑單菌落進行革蘭染色和生化鑒定。

1.4 藥敏試驗 按照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI,2015)規定的瓊脂稀釋法測定菌株對14 種抗菌藥的敏感性,并根據CLSI 中耐藥折點進行耐藥判讀。

1.5 ESBLs 基因型及磷霉素耐藥基因檢測 通過水煮法提取DNA,根據Liu[8]報道的blaCTX-M-1G引物序列,Bri?as[9]報道的blaCTX-M-9G引物序列和Hou[10]報道的磷霉素耐藥基因fosA3、fosC2 和fosA及PCR反應體系進行耐藥基因檢測：水18.375 μL,PCR Buffer 2.5 μL,dNTP 2 μL,上下游引物各0.5 μL,模板DNA 1 μL,Taq0.125 μL。擴增條件為：95℃預變性5 min,(95 ℃,30 s+55 ℃,30 s+72 ℃,30 s)×30 個循環,再延伸5 min。擴增完畢后用1%瓊脂糖電泳,在凝膠成像系統上觀察電泳結果。經電泳鑒定的PCR 產物送至華大基因科技服務有限公司測序,并進行序列同源性分析。

2 結果

2.1 細菌的分離鑒定結果 采集的336 個泄殖腔拭子中,經鑒定共獲得336 株大腸桿菌,其中蛋雞源153 株,肉雞源183 株。

2.2 藥敏試驗結果 336 株大腸桿菌對四環素、氨芐西林和多西環素的耐藥率較高,均達到78%以上,分別為85.4%、82.7%和78.6%,其余依次是萘啶酸(72.6%)、氟苯尼考(67.0%)、鏈霉素(56.0%)、恩諾沙星(50.0%)、頭孢噻肟(44.9%)、卡那霉素(40.2%)、頭孢噻呋(38.4%)、環丙沙星(37.8%)、慶大霉素(25.6%)、左氧氟沙星(26.8%)和磷霉素(28.7%)。336 株大腸桿菌中,肉雞源大腸桿菌對除氟苯尼考外的13種藥物的耐藥率均顯著高于蛋雞源大腸桿菌的耐藥率(P＜0.05),詳見圖1。

圖1 不同來源雞源大腸桿菌對14 種抗菌藥物的耐藥率

2.3 ESBLs 基因及磷霉素耐藥基因PCR 結果 在336 株大腸桿菌中,123 株(36.6%)攜帶blaCTX-M型ESBLs,攜帶率最高的為blaCTX-M-9G(24.1%,81 株),其次為blaCTX-M-1G(15.5%,52 株),其中10 株同時攜帶blaCTX-M-9G和blaCTX-M-1G基因,其他基因型ESBLs均未檢測出。在肉雞源大腸桿菌中blaCTX-M-9G攜帶率為33.9%,blaCTX-M-1G攜帶率為20.8%,其中包括10 株同時攜帶blaCTX-M-9G和blaCTX-M-1G基因的菌株;蛋雞源大腸桿菌中blaCTX-M-9G攜帶率為12.4%,blaCTX-M-1G為9.2%;值得注意的是,肉雞源大腸桿菌CTX-M 型ESBLs 攜帶率(49.2%)顯著高于蛋雞源大腸桿菌CTX-M 型ESBLs 攜帶率(21.6%)(P＜0.01),具體見表1。336 株大腸桿菌中fosA3 基因攜帶率為21.7%,fosA和fosC2 均未檢測出,并發現肉雞源大腸桿菌fosA3 檢出率(27.9%),顯著高于蛋雞源大腸桿菌fosA3 的檢出率(14.4%)(P＜0.01),具體見表2。值得注意的是,在123 株產CTX-M 型ESBLs大腸桿菌中,有66 株(53.7%)同時攜帶fosA3,顯著高于非產ESBLs 大腸桿菌中fosA3 的攜帶率

(3.3%)(P＜0.01)。

表1 336 株大腸桿菌中ESBLs 基因檢測結果

表2 336 株大腸桿菌中磷霉素耐藥基因結果

3 討論

大腸桿菌是人和動物體內腸道的共生菌,可作為一些可轉移耐藥質粒的重要儲存庫[11]。在各種可移動元件攜帶的耐藥基因中,ESBLs 能水解作為目前人類臨床和獸醫臨床的常用藥和關鍵藥的第三、第四代頭孢菌素,它的出現和散播引起了廣泛注意[12]。其中從豬肛門內和禽泄殖腔中分離到的產ESBLs 大腸桿菌報道較多,產ESBLs 菌株不僅對氟喹諾酮類、頭孢菌素類藥物表現出較高耐藥率而且對多種抗菌藥均表現出交叉耐藥和多重耐藥[13]。當今,產ESBLs 的大腸桿菌不斷增多,耐藥日益嚴重,其已成為人類研究的重要課題。磷霉素主要用于治療金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌等引起的軟組織感染和單純性尿路感染,目前未用于動物疾病的治療,但是雞源大腸桿菌內卻存在磷霉素耐藥基因,因此對雞源大腸桿菌進行磷霉素耐藥基因調查格外重要。

隨著養禽業不斷發展,禽源大腸桿菌的耐藥率與日俱增。本試驗對山東地區雞源大腸,桿菌對14種常用抗菌藥進行耐藥檢測,結果表明,山東地區雞源大腸桿菌對氨芐西林、氟苯尼考、多西環素、四環素和萘啶酸的耐藥率均在67%以上,對頭孢菌素類藥物的耐藥率已經高達38.4%～44.9%;對氟喹諾酮類藥物的耐藥率在26.8%～50.0%。王慧真[14]等報道的河北地區雞源大腸桿菌對頭孢菌素類藥物耐藥率為41%～70%,氟喹諾酮類為58%～70%,氨基糖苷類為33%～70%;李赫[15]報道的遼寧省盤錦地區動物源大腸桿菌對頭孢菌素類藥物耐藥率為37%～52%,喹諾酮類為33%～89%,氨基糖苷類為48%～89%;本試驗結果與其他地區這些已有報道相一致,表明我國禽源大腸桿菌耐藥十分嚴重。2013 年,Hou[16]等將從廣東養殖場分離的892 株雞源大腸桿菌進行磷霉素耐藥率檢測,其耐藥率為1.3%,顯著低于本研究2015-2016 年的雞源大腸桿菌的耐藥率(28.7%),這說明磷霉素耐藥在近年來呈上升趨勢。本研究發現,蛋雞源大腸桿菌對各種藥物(氟苯尼考除外)的耐藥率均顯著低于肉雞源大腸桿菌的耐藥率,分析其原因可能是由于肉雞的養殖周期短密度大,易發生細菌性疾病,使肉雞飼養中抗菌藥的使用劑量及頻率明顯高于蛋雞所致。因此,肉禽生產中抗菌藥使用的監管力度亟待加強。

ESBLs 基因型中最早報道的為TEM 型,但在近年來國內外報道的動物源大腸桿菌中ESBLs 的主要流行型為CTX-M 型[17],如香港Ho[11]等和英國Horton[18]等報道的動物源產ESBLs 大腸桿菌中,CTX-M 型的攜帶率均超過90%。我國謝榕[19]等報道在河北地區雞源大腸桿菌中CTX-M 型ESBLs 的攜帶率為66.3%,劉保光等[20]報道鴨源大腸桿菌ESBLs 的檢出率為33.0%,本研究在山東地區檢測CTX-M 型ESBLs 攜帶率為36.6%。這說明在不同地區和不同動物源大腸桿菌中產ESBLs 的陽性率存在差異。Hou[16]等將從廣東養殖場分離的892株雞源大腸桿菌進行磷霉素耐藥率檢測,最終得到12 株(1.3%)耐磷霉素大腸桿菌,其中10 株存在fosA3 基因(1.1%);本研究中336 株大腸桿菌中fo-sA3 基因攜帶率為21.7%,明顯高于廣東地區,其可能原因為本研究所用菌株分離自2015-2016 年且隨著年代的變化磷霉素耐藥發生擴散導致。研究還發現fosA3 基因對磷霉素的耐藥率起重要決定作用。本研究顯示,山東地區肉雞源大腸桿菌中fosA3和CTX-M 型ESBLs 的檢出率均顯著高于蛋雞源大腸桿菌(P＜0.01),其原因可能為肉禽養殖規模大,養殖時間短,為防止疾病的發生而使用抗生素造成的。值得注意的是,fosA3 在產CTX-M 型ESBLs 大腸桿菌中的攜帶率(53.7%)顯著高于非產ESBLs大腸桿菌中的攜帶率(3.3%)(P＜0.01),這說明fosA3 與CTX-M 型ESBLs 聯系密切,且隨著頭孢菌素類藥物在養禽中的應用可促進磷霉素耐藥的傳播。近年來,由產ESBLs 的腸桿菌和氟喹諾酮耐藥大腸桿菌引起的人尿路感染越來越多,這使磷霉素這一“老藥”成為治療該感染的有效藥物。獸醫臨床使用廣譜抗生素,產生的攜帶ESBLs 和磷霉素耐藥基因的菌株會通過直接接觸或食物鏈等方式進入人體,給尿路感染的治療等帶來巨大難題,對此我們應給予重視。本研究獲得的耐藥率和耐藥基因結果,可為養雞場細菌性疾病的用藥提供理論指導。