黃芪多糖脂質體的制備及表征研究

張勇軍,巫輔達,徐志高,巴 娟,鄧 樺,楊 鴻

(佛山科學技術學院生命科學與工程學院,廣東 佛山 528231)

黃芪是一味大宗藥材,最早被記載于中醫四大經典著作《神農本草經》[1-2]。黃芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)是黃芪的主要有效成分,具有廣泛藥理活性,包括調節心血管、增強免疫、抗病毒、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射等作用[3-5]。目前大部分傳統中藥多糖制劑存在著穩定性差、生物利用度低、易被降解及對細胞穿透力弱等缺點,影響了中藥多糖藥效的發揮。脂質體是一類具有靶向特定給藥、緩慢釋放、提高藥效與藥物穩定性、降低藥物不良反應的優點,近年來已被廣泛研究應用作為藥物的載體,中藥脂質體制劑的研制成為中藥制劑研究的熱點[6-9]。因此開展黃芪多糖脂質體制備方法及表征研究,對提高中藥多糖制劑的生物利用度、治療效果、降低使用劑量等有重要臨床意義,對中藥多糖新制劑的研發具有積極推動作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 大豆卵磷脂(合肥博美生物科技有限公司,批號：DP4711);膽固醇(合肥博美生物科技有限公司,批號DC1212)。

1.1.2 主要儀器 RE-201D 旋轉蒸發儀(鄭州予華儀器制造有限公司);UV-6000 型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司);MS-H-Pro+磁力攪拌器(大龍興創實驗儀器有限公司);HN1012 超聲波清洗機(廣州市華南超聲設備有限公司);FEI Technai G2 F20 型透射電子顯微鏡(Philips 公司);納米顆粒分析儀SZ-100Z(日本HORIBA 公司);真空冷凍干燥機(美國LABCONCO 公司)。

1.2 方法

1.2.1 多糖的制備 采用正交試驗優選出的水提醇沉方法進行提取,以苯酚-濃硫酸法測定其多糖含量。多糖提取最佳工藝：料液比1∶16、浸提溫度90 ℃、浸提時間90 min、提取次數3 次,紗布過濾,沉淀完全后,取上清液抽濾,濾液采用旋轉蒸發儀進行濃縮,加無水乙醇沉淀12 h,沉淀物經大孔樹脂純化,真空冷凍干燥,即得黃芪多糖。經測定黃芪多糖平均質量分數57.79 %。

1.2.2 檢測波長的確定 精密吸取25 mg/L 葡萄糖對照品溶液2 mL,加入5 %苯酚溶液1 mL,混勻,加入濃硫酸5 mL,混勻,沸水浴15 min,冷水浴5 min,以蒸餾水為空白對照,在200～800 nm 范圍內掃描,在490 nm 處出現最大吸收。空白脂質體A在此處無吸收,故選擇檢測波長490 nm。

1.2.3 脂質體的制備 采用逆向蒸發法[10]：將一定比例的大豆卵磷脂和膽固醇溶于氯仿,采用旋轉蒸發儀進行減壓旋轉蒸發,使圓底燒瓶內壁形成一層半透明的淡黃色脂質薄膜,加入乙醚將薄膜溶解,加入適量黃芪多糖濃度10 mg/mL 磷酸鹽緩沖溶液(pH 值=7.4),進行充分混勻,在一定的超聲功率和時間下超聲混勻,置于旋轉蒸發儀上減壓抽吸至乙醚揮發完全,即得到乳白色的APS 脂質體懸液,4 ℃保存備用。

1.2.4 脂質體包封率的測定

1.2.4.1 標準曲線繪制 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品100 mg,置100 mL 容量瓶中,加蒸餾水溶解并定容至刻度,即得1 mg/mL 的儲備液,從中吸取10 mL 置100 mL 容量瓶中,加水稀釋至刻度,即得0.1 mg/mL 的標準液。分別吸取標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 至比色管中加蒸餾水適量至2 mL,再各加入5 %苯酚溶液1 mL,混勻,加入濃硫酸5 mL,混勻,沸水浴15 min,冷水浴5 min,在490 nm 處測定吸光度。以葡萄糖濃度(C)對吸光度(A)進行回歸,得回歸方程Y=65.078X+0.324 4,R2=0.999 8,結果表明葡萄糖在2.5～12.5 μg/mL 之間線性關系良好。

1.2.4.2 精密度試驗 吸取相同質量濃度黃芪多糖溶液,以蒸餾水為空白對照,于490 nm 處測量其吸光度(n=5)。吸光度值RSD 為0.35%,表明本試驗所用儀器具有良好的精密度。

1.2.4.3 穩定性試驗 吸取相同質量濃度黃芪多糖溶液,分別于0,30,60,90,120,150,180 min 在490 nm 處測定其吸光度。經測定多糖溶液在3 h 內的吸光度值RSD 為0.43%,表明多糖溶液的穩定性良好。

1.2.4.4 加樣回收率試驗 精密稱取葡萄糖標準品溶液,分別配置成高、中、低3 個質量濃度,加入適量空白脂質體,于490 nm 處測定其吸光度值。經測定平均加樣回收率為99.56%,RSD 為3.36%。

1.2.4.5 包封率測定 采用超速離心法測定[11]：吸取2 mL 脂質體至離心管中,以10 000 r/min 冷凍離心30 min,吸取上清液1 mL,加入蒸餾水將其定容至50 mL,采用苯酚-濃硫酸法測定其多糖含量,在490 nm 處測定吸光度,計算其上清液中游離多糖濃度。按下公式計算包封率：

包封率=(W總-W游)/W總×100%

W總為總投入的藥物量,W游為游離的藥物量。

1.2.5 制備工藝設計 在前期預試驗的基礎上,對各項因素進行考察,逐步篩選出對脂質體包封率影響較大的3 個因素作為考察對象,即膜材比(大豆卵磷脂與膽固醇質量比)、脂藥比(大豆卵磷脂與藥物質量比)和超聲時間對脂質體的制備影響最大。因此,以膜材比(A)、脂藥比(B)和超聲時間(C)為考察因素,按L9(34)正交表安排試驗。因素水平見表1。

表1 因素水平

1.2.6 體外釋藥試驗 制備相同質量濃度黃芪多糖PBS 溶液(pH 值7.4),取兩者各5 mL 于處理好的透析袋中,浸入200 mL PBS 溶液(pH 值7.4)釋放介質,于100 r/min、(37±0.5)℃下恒溫磁力攪拌,于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h 吸取1.0 mL 透析液,同時補加同溫等量釋放介質。加水稀釋透析液,測定吸光度,計算累積釋放率,繪制體外釋放曲線。

1.2.7 脂質體形態及粒徑測定 吸取適量脂質體混懸液于銅網上,待懸液干燥后,以2%磷酸鎢水溶液滴到碳膜上進行負染。待負染液干燥后置透射電鏡下觀察。脂質體采用水當做分散介質,通過納米顆粒分析儀測量其粒徑分布情況及其平均大小。

2 結果

2.1 正交試驗結果分析 根據正交試驗結果分析得知,以包封率為指標,對各因素影響的大小為脂藥比(B)＞膜材比(A)＞超聲時間(C),其最佳制備工藝為A3B1C1。因此,優選出最佳脂藥比4∶1,最佳膜材比8∶1。根據方差分析,進行F 檢驗,可知超聲時間對脂質體的包封率影響較小,從實現工廠化生產考慮,生產規模大,膜材與藥物之間可能混合不均勻,為了更好提高脂質體的包封率,因此選擇超聲時間90 s 較好。正交試驗結果見表2,方差分析結果見表3。

表2 L9(34)正交試驗結果

表3 方差分析

2.2 體外釋藥試驗結果 由中插彩版圖1 可知,黃芪多糖脂質體比多糖溶液釋藥率明顯減小。在4 h 時,多糖溶液釋放率達到69.21%,在8 h 時已基本達到釋放完全;脂質體在4 h、8 h 時累積釋放率分別為 48.09%、55.13%,24 h 時 達 到62.67%,表明制備的黃芪多糖脂質體具有一定的緩釋作用。

圖1 體外釋放曲線

2.3 脂質體形態及粒徑測定 由圖2 和圖3 可知,透射電鏡下觀察,黃芪多糖脂質體粒徑較均勻,形態良好,呈橢圓形或圓球形,脂質體可見明顯的雙層膜結構,平均粒徑在557 nm。

圖2 APS 脂質體透射電鏡圖

圖3 脂質體的粒徑分布

3 討論

近年來,國內外對脂質體制備的研究方法主要有注入法、熔融法、薄膜分散法、超聲波分散法、逆向蒸發法、冷凍干燥法、高壓乳勻法、表面活性劑增溶法以及采用多種方法聯合制備等[12]。逆向蒸發法適合生物大分子與水溶性藥物脂質體的制備,此方法得到的脂質體包封率較高,且制備方法簡單、工藝可行。

包封率是指在脂質體中被包封的藥量占加入總藥量的百分比。可作為脂質體內在質量好壞的評價指標。目前脂質體包封率的測定方法主要有透析法、葡聚糖凝膠柱色譜法、超濾膜濾過法、魚精蛋白凝聚法等,以上測定方法均有其局限性[13]。透析法需不斷更換透析液,且消耗時間長;葡聚糖凝膠柱色譜法需大量洗脫液,操作比較繁瑣;超濾膜濾過法需較好的超濾管膜,適合水溶性藥物的測定;魚精蛋白凝聚法適合于帶正電荷或小分子藥物的測定。采用超速離心法測定包封率,分離速度快,分離效果較好,操作簡單[14]。

一般認為提高脂藥比可增大脂質體的包封率。本試驗表明,在膜材比相同的條件下,隨著脂藥比的增大包封率未出現顯著增大,反而出現包封率下降的情況[1]。可能由于膜材的比例太低無法達到完全包封藥物的條件,因此導致藥脂比與包封率成反比。

體外釋藥試驗表明,與黃芪多糖溶液相比,黃芪多糖脂質體外釋藥率明顯減小,說明黃芪多糖脂質體具有一定的緩釋作用。

制備黃芪多糖脂質體的最佳工藝為膜材比8∶1,脂藥比4∶1,超聲時間90 s,包封率93.77 %,且具有較高的包封率和良好的緩釋作用,脂質體為乳白色懸液,其形態為橢圓形或圓球形,雙層膜結構,平均粒徑在557 nm,說明脂質體作為黃芪多糖載體是可行的。