兔支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定與調查

馬超鋒

(1.河南省信陽市動物疫病預防控制中心,河南 信陽 464000)

支氣管敗血波氏桿菌(B6)是一種革蘭陰性小桿菌,可以引起多種哺乳動物(包括豬、兔、綿羊、牛、馬、犬、鼠類等)呼吸道的急性或慢性炎癥[1-2],輕則影響動物生長、重則造成家畜死亡,給養殖場戶帶來一定經濟損失。筆者在臨床工作中,時常接到發生呼吸道癥狀的病兔,為更好的防治該病,我們將收集到的病兔進行細菌分離、鑒定與藥敏試驗,并對河南部分地區的兔支氣管敗血波氏桿菌發病情況進行了初步調查,以期為該病的防控提供指導。

1 材料與方法

1.1 病料收集 2018 年11 月信陽地區某兔場兔群發生打噴嚏、呼吸困難、不食、消瘦及鼻炎癥狀,無菌取病死兔的鼻拭子或鼻腔分泌物,保存備檢;于2016 年7 月-2018 年6 月,在河南部分地區(信陽、焦作、濟源、三門峽、駐馬店和洛陽等地)有呼吸道癥狀兔養殖場采集鼻拭子樣品684 份,冷凍保存備檢。

1.2 主要試劑 DNA 提取試劑盒,購自TaKaRa 公司;普通TapDNA 聚合酶、10×緩沖液、dNTP、DNA Marker、瓊脂糖等,購自寶生物工程(大連)有限公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;TSB 培養基、LB 培養基、麥康凱培養基、血瓊脂平板、胎牛血清、細菌生化鑒定管、藥敏片(部分自制)等,購自鄭州安圖綠科生物公司;革蘭染色試劑根據參考文獻[3]自行配置。

1.3 主要儀器 生物顯微鏡(日本Nikon 公司);5424R 高速臺式冷凍離心機(德國Eppendorf 公司);核酸提取儀(西安天隆科技有限公司);PCR 儀(德國Biometre 公司);電泳儀、凝膠成像系統(以色列DNA 公司);HH 數顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇晶玻實驗儀器廠);SPX-150B 智能型生化培養箱(上?，樮帉嶒炘O備有限公司)。

1.4 細菌分離鑒定及鏡檢 將新鮮無菌采集的兔鼻腔分泌物,劃線接種于血瓊脂平板、麥康凱平板上,37 ℃溫箱培養24～48 h 后,觀察菌落形態,挑取優勢生長菌落繼續純培養;取兔鼻腔分泌物、單個培養基菌落涂片,革蘭染色,顯微鏡下觀察。

1.5 生化鑒定 在含有5%胎牛血清的LB 液體培養基中接種純培養物,取少量培養液加入各個生化鑒定管中,在溫箱中37 ℃培養24 h 后,觀察并記錄結果。

1.6 細菌的PCR 鑒定及測序 采用DNA 提取試劑盒提取分離菌及采集的鼻拭子的DNA。

參考文獻[4],建立基于多殺性巴氏桿菌16S rDNA 基因的PCR 檢測方法;上游引物：5′-AGTGGGATTAGGTAGTTGGT-3′,下游引物：5′-CTGTAATTAACGTCAATG-3′,擴增片段大小為258 bp;反應條件：95 ℃5 min,94 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃1 min,35 個循環,最后72 ℃延伸10 min。

參照筆者建立的兔敗血支氣管波氏桿菌PCR檢 測方法[5]操作;上游引物：5′-GGCACCATCAAAACGCAGAGGGG-3′,下游引物：5′-ATTACCGAGTTGGGCGGGGCTG-3′,擴增片段大小870 bp;反應條件：95 ℃預變性5 min;94 ℃變性40 s,57 ℃退火30 s,72 ℃復性1 min,30 個循環,72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。對采集的樣品及培養物進行PCR 擴增,電泳檢測,提取陽性質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,并將測序結果進行同源性比較。

1.7 藥敏試驗 參考相關文獻[3,6-9],利用紙片法測定分離的支氣管敗血波氏桿菌對慶大霉素、克林霉素、恩諾沙星、諾氟沙星、鹽酸多西環素、阿莫西林、氟苯尼考、鏈霉素、頭孢克肟、頭孢拉定等10 種藥物的敏感性,通過測定抑菌圈的直徑(Φ)判定藥物對病原菌的敏感性：Φ≥15 mm 為高度敏感;6 mm≤Φ＜15 mm 為中度敏感;Φ＜6 mm 為耐藥。

1.8 兔支氣管敗血波氏桿菌感染情況調查 將采自河南信陽、焦作、濟源、三門峽和洛陽等地的684份兔鼻拭子樣品進行PCR 檢測,調查兔群支氣管敗血波氏桿菌的陽性率。

2 結果

2.1 細菌分離及鏡檢結果 分離菌在血瓊脂平板培養48 h 后,形成隆起的中等大小的圓整、光滑、濕潤、透明菌落,邊緣整齊,產生β 溶血環;分離菌在麥康凱培養基上長出的菌落呈藍灰色。革蘭染色后,顯微鏡下觀察,可見單個散在、兩極染色的球桿菌,革蘭陰性(見中插彩版圖1),結合生化鑒定結果初步判定為支氣管敗血波氏桿菌。

圖1 分離菌株的染色鏡檢圖片(10×100)

2.2 生化鑒定結果 該分離菌株生化鑒定結果,能利用檸檬酸鹽,還原硝酸鹽,分解尿素,觸酶、氧化酶、脲酶陽性;不發酵糖類,不產生硫化氫,甲基紅、V-P 和吲哚試驗陰性。

2.3 分離菌株PCR 鑒定結果 將分離細菌進行PCR 擴增、1%瓊脂糖凝膠電泳后,巴氏桿菌擴增結果為陰性;在870 bp 處出現明顯條帶,與預期目的片段一致,將測序結果與已發表的兔波氏桿菌基因序列比對,同源性達99.2%以上,確定本試驗分離菌為支氣管敗血波氏桿菌(見圖2)。

圖2 被檢樣品兔支氣管敗血波氏桿菌PCR 擴增圖

2.4 藥敏試驗結果 對分離菌株藥敏試驗結果見表1,分離細菌對慶大霉素、恩諾沙星、氟苯尼考高敏;對諾氟沙星、鹽酸多西環素中敏;對克林霉素、阿莫西林、鏈霉素、頭孢克肟、頭孢拉定不敏感。

2.5 兔波氏桿菌調查情況 利用PCR 方法,將采自河南信陽、駐馬店、濟源等地區的684 份兔鼻拭子樣品進行PCR 檢測,81 份樣品陽性,陽性率為11.8%。從表2 可以看出,各地陽性率有差異。

表1 分離菌藥敏試驗結果

表2 河南不同地區兔群波氏桿菌感染情況

3 討論

波氏桿菌病是一種重要的人獸共患病,對人畜健康均能造成較大威脅,因此對波氏桿菌的研究具有重要的公共衛生意義。對兔群來說,在秋冬季節及氣溫驟變時,較易發生呼吸道疾病,而且以發病率高、傳染性強、復發率高為特征,多為混合感染,給診斷和治療帶來難度。兔傳染性鼻炎是由多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌混合或單一感染引起的疾病,不同品種、不同年齡均易感,影響兔群采食和生長,是造成家兔生長遲緩的重要因素。本試驗采用細菌分離培養、鏡檢、生化及PCR 鑒定等手段,在信陽地區發生呼吸道疾病的兔群中分離到兔源支氣管敗血波氏桿菌;為防治該病,采用藥敏試驗篩選出恩諾沙星、氟苯尼考、慶大霉素為高敏藥物。根據藥敏試驗結果,推薦養殖戶采用慶大霉素配合清瘟敗毒散拌料連用7 d 防治,后經回訪得知,兔場病情已得到有效控制。

對河南信陽、濟源、洛陽、焦作、三門峽和駐馬店等部分地區兔群的波氏桿菌感染情況進行了調查,總體陽性率為11.8%,感染率較高的濟源為15.4%,最低的信陽為8.9%,該菌在我省不同地區兔場不同程度存在,從業者要加強對兔支氣管敗血波氏桿菌病的診斷和防治,以減少該病帶來的經濟損失。

兔支氣管敗血波氏桿菌是呼吸道傳染病病菌,可經病兔噴嚏、咳嗽產生的飛沫等分泌物污染的飼料、飲水、物品和環境傳播,建議兔場采取綜合性防控措施來防治該?。阂皇菆猿肿苑弊责B,防止外來病菌進入兔群,定期采用細菌學或者血清學方法對兔群進行抽檢,發現陽性立即淘汰;二是引種時,首先要隔離觀察1 個月,并進行檢測,及時淘汰陽性兔,無可視癥狀后再轉群;三是加強飼養管理,改善飼養環境,給兔群營養合理的飼料,定期在飼料中添加保健性藥物,在季節變換和氣溫驟變時要及時在飼料或飲水中添加抗應激藥物,提高兔群抵抗力;四是兔舍的清潔衛生要做好,定期驅蟲、滅鼠,及時清糞,保持兔舍合適的溫濕度,減少各種應激因素;五是發病兔群可以制備自家苗,有針對性的免疫兔群。