鷹嘴豆芽素A 免疫佐劑作用試驗

陳洪博,李培華,蔡 翔,邱龍新

(1.龍巖學院 生命科學學院,福建 龍巖364012;2.福建省家畜傳染病防治與生物技術重點實驗室,福建 龍巖 364012)

疫苗免疫是防控動物傳染病的重要手段之一,近年來疫苗已使用許多亞單位抗原和多肽抗原,此類抗原具有純度高、安全性好等特點,但免疫原性較差,不能有效的誘導免疫反應,因此使用佐劑來提高其免疫原性具有重要意義。目前應用于畜禽的疫苗佐劑有弗氏佐劑、氫氧化鋁等,此類佐劑雖然均可提高疫苗的免疫效果,但在使用的安全性上還存在不足。與合成藥物相比,中藥具有多效性、雙向免疫調節性、不良反應少等特點,因此將中藥開發研制成安全有效的疫苗佐劑具有廣闊的應用前景。鷹嘴豆芽素A(BiochaninA,BioA)屬于黃酮類化合物,是紅車軸草中的主要有效成分,紅車軸草中含有大量異黃酮和黃酮類物質,其異黃酮是免疫調節劑及免疫刺激劑,具有抗病毒、抗腫瘤及消炎的作用。研究發現紅車軸草總黃酮短期內在一定濃度范圍內可通過增強巨噬細胞的吞噬能力,增強小鼠特異性免疫功能[1]。BioA 作為紅車軸草異黃酮的主要有效成分,目前研究主要集中在其抗腫瘤和抗氧化等方面,研究發現,BioA 可調節細胞因子分泌、減輕肝損傷、保護大腦神經元等[2-4],而有關BioA 的免疫佐劑作用尚未見報道,本試驗擬利用不同濃度BioA 與雞卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)聯合免疫小鼠,通過檢測免疫小鼠IgG 及其亞型抗體水平、脾臟淋巴細胞增殖、細胞因子分泌和CD4+、CD8+T 細胞亞群變化,探討BioA 作為疫苗免疫佐劑的應用前景,從而為開發新的中藥佐劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 鷹嘴豆芽素A、OVA、LPS 和ConA(Sigma 產品);HRP 標記山羊抗小鼠IgG 抗體、IgG1抗體、IgG2a 抗體(Abcam 產品);CCK-8 試劑盒(碧云天生物技術有限公司產品);抗小鼠CD3e-PECy5、CD4-FITC、CD8a-PE 單克隆抗體(eBioscience產品);IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ 和TNF-α(上海西唐生物科技有限公司產品);氫氧化鋁膠佐劑(中國牧工商集團有限公司產品)。

1.2 實驗動物 清潔級雌性ICR 小鼠60 只,體重18～22 g,由上海實驗動物中心提供[合格證號：SCXK(滬)2016-0003],飼養于IVC 獨立送風飼養籠具,飼喂高壓滅菌飼料和水,室內溫度25±5 ℃,濕度50%±10%,適應性飼養1 周后開始試驗。

1.3 分組及免疫程序 將60 只ICR 小鼠隨機分為6 組,每組10 只小鼠,分別是空白對照組(生理鹽水)、OVA 抗原組、OVA 抗原加鋁膠佐劑組(200 μg/只)、OVA 抗原加BioA 低劑量組(50 μg/只)、OVA抗原加BioA 中劑量組(100 μg/只)和OVA 抗原加BioA 高劑量組(200 μg/只),OVA 注射量為10 μg/只,每只小鼠皮下注射0.1 mL OVA 抗原+0.1 mL不同濃度的樣品,小鼠首免后21 d 進行二次免疫,二免后2 周殺小鼠用于后續試驗。飼養過程中同時觀察2 次免疫后小鼠精神狀態和行為變化,記錄試驗結束前1 d 小鼠體重。

1.4 IgG 及其亞型檢測 間接ELISA 法檢測抗OVA 抗體IgG、IgG1 和IgG2a 水平,具體方法參考文獻[5]。

1.5 淋巴細胞增殖檢測 無菌操作取小鼠脾臟,制備淋巴細胞懸液,調整細胞濃度到2.5×106個/mL備用。培養液LPS 終濃度為7.5 μg/mL,ConA 和OVA 終濃度為10 μg/mL,設置陰性對照和空白對照。培養72 h,培養結束前4 h 加入10 μL CCK-8,酶標儀測定OD450nm值。淋巴細胞刺激指數(Stimulationindex,SI)=(OD刺激孔-OD空白孔)/(OD未刺激孔-OD空白孔)。

1.6 血清細胞因子濃度測定 按照ELISA 試劑盒操作步驟,檢測血清中IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ 和TNF-α 濃度。

1.7 外周血淋巴細胞亞群測定 收集小鼠肝素鈉抗凝外周血,取100 μL 抗凝血裂解紅細胞,洗滌并重懸細胞,用BD FACS Calibur 流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群CD4+和CD8+比值變化,FlowJo 7.6軟件分析試驗結果。

1.8 數據分析 試驗結果表示為平均值±標準差,使用SPSS 20.0 軟件單因素方差分析和LSD 法進行組間比較,P＜0.05 代表差異顯著,P＜0.01 代表差異極顯著。

2 結果

2.1 臨床觀察 一免和二免后小鼠的精神狀態、活動能力及皮毛狀態等均無異常變化;試驗結束前1 d稱重,與對照組相比,各佐劑組小鼠的體質量均未見顯著變化,表明BioA 和鋁膠佐劑對小鼠的體重變化無明顯影響。

2.2 抗OVA 特異性抗體IgG、IgG1 和IgG2a 的檢測 OVA 抗原與BioA 共免疫小鼠抗體水平檢測顯示,二免后鋁膠組和BioA 組IgG 抗體水平極顯著高于OVA 組(P＜0.01),鋁膠組IgG 抗體水平高于BioA 組,但無顯著差異,BioA 中劑量組IgG抗體水平高于低劑量組高劑量組,但三組之間無顯著差異(圖1A)。IgG1 抗體濃度檢測結果表明,與OVA 組相比,鋁膠組和BioA 組極顯著升高(P＜0.01),鋁膠組IgG1 水平顯著高于BioA 組(P＜0.05),BioA 三組之間無顯著差異,但中劑量組IgG1 抗體水平最高(圖1B)。IgG2a 抗體濃度檢測結果表明,與OVA 組相比,BioA 中劑量組抗體水平顯著升高(P＜0.05),其他組與OVA 組相比有升高趨勢但差異不顯著(圖1C)。

2.3 淋巴細胞增殖試驗結果 小鼠免疫BioA 100 μg 后,脾臟淋巴細胞體外受ConA、LPS 和OVA 刺激產生的淋巴細胞增殖能力顯著或極顯著高于OVA 組(P＜0.05 或P＜0.01);與OVA 組相比,BioA 低劑量組和高劑量組脾臟淋巴細胞受ConA 刺激后增殖能力顯著升高(P＜0.05)。與OVA 組相比,鋁膠佐劑組和BioA 組脾臟淋巴細胞接受OVA 刺激后淋巴細胞增殖水平有升高,但差異不顯著(圖2)。

2.4 細胞因子濃度檢測結果 與OVA 組相比,BioA組和鋁膠組均能顯著提高IL-2、IL-4 的濃度(P＜0.05),鋁膠組的表達量要高于BioA 組,但二者之間無顯著差異;BioA 能顯著提高IFN-γ、TNF-α 的濃度(P＜0.05),而鋁膠組能提高IFN-γ、TNF-α 的表達,但與OVA 組相比無顯著差異;BioA 組和鋁膠組均能提高IL-5 的濃度,但與OVA 組相比無顯著差異(圖3)。

圖1 小鼠血清IgG 抗體及其亞型水平

圖2 小鼠脾臟淋巴細胞增殖結果

圖3 小鼠血清細胞因子檢測結果

2.5 T 淋巴細胞亞群的檢測 OVA 組、鋁膠組和BioA 組CD4+和CD8+T 淋巴細胞檢測結果分別如圖4C、4D 和4E 所示,結果顯示,與OVA 組比較,OVA聯合BioA 或鋁膠極顯著或顯著升高小鼠外周血中CD4+T 淋巴細胞比例(P＜0.05 或P＜0.01),BioA組較鋁膠組略有升高,但兩組之間差異不顯著;與OVA 組比較,OVA 聯合BioA 或鋁膠可降低CD8+T淋巴細胞的比例,但三組之間差異不顯著;同時,鋁膠組和BioA 組CD4+/CD8+T 淋巴細胞的比值也顯著或極顯著升高(P＜0.05 或P＜0.01);與OVA 組和鋁膠組相比,BioA 組CD3+/CD4-/CD8-細胞數量顯著降低,表明BioA 可刺激機體淋巴細胞的分化。

3 討論

新一代的疫苗,特別是那些基于重組蛋白和DNA 疫苗,可能會比傳統疫苗的反應原性和免疫原性弱,因此,迫切需要開發和改進疫苗佐劑。佐劑對機體免疫反應有顯著影響,可使機體免疫系統趨向于Th1 或Th2 免疫類型[6-7]。雖然在臨床生產中疫苗已經使用了多種佐劑,但這些佐劑大多只引起Th2 型抗體反應,或有不良副作用,限制了它們在疫苗中的潛在應用[8-10]。目前常用的佐劑主要刺激Th2 型免疫應答,不能刺激CTL 產生,此種免疫反應通常對細胞內病原體無效,Th1/Th2 型免疫應答很大程度上依賴于佐劑類型[11-13]。

圖4 外周血中CD4+和CD8+T 淋巴細胞的表達

本試驗中BioA 和OVA 抗原聯合免疫小鼠后,可提高IgG 抗體水平,且具有劑量依賴性,100 μg 劑量組效果最佳,然而表達量低于鋁膠組,但兩者之間無顯著差異;鋁膠組和BioA 組均極顯著提高IgG1 的表達(P＜0.01),與BioA 組相比鋁膠組IgG1 的表達量顯著升高(P＜0.05);BioA 100 μg 劑量組可顯著提高IgG2a 表達量(P＜0.05),而鋁膠對IgG2a 的表達量無顯著影響。IgG 抗體及其亞型檢測結果表明鋁膠佐劑能顯著誘導Th2 型免疫反應,而對Th1 型免疫反應效果較差,BioA 佐劑在提高Th2 型免疫反應方面不如鋁膠佐劑,但對Th1 型免疫反應要優于鋁膠。淋巴細胞增殖試驗結果表明,BioA 組受ConA、LPS 和OVA 刺激后淋巴細胞增殖能力均顯著高于OVA 組(P＜0.05),因此,BioA能同時刺激T、B 淋巴細胞的增殖。細胞因子檢測結果表明,BioA 可提高Th1 型細胞因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α)和Th2 型細胞因子(IL-4)的表達量,而鋁膠佐劑對Th2 型細胞因子(IL-4)的表達量顯著升高,對Th1 型細胞因子(IFN-γ 和TNF-α)的表達無顯著作用,提示BioA 佐劑可誘導機體Th1 和Th2 型免疫應答反應,有助于細胞免疫體液免疫的產生。

CD4+T 細胞能調控和輔助其他淋巴細胞發揮功能,CD8+T 細胞具有免疫抑制和細胞毒性作用,CD4+/CD8+比值是判斷機體免疫功能狀態的重要指標,正常小鼠CD4+/CD8+比值為1～ 2[14-15]。本研究中BioA 佐劑能顯著增加CD4+T 細胞表達(P＜0.05),對CD8+T 細胞表達無顯著影響,但CD4+/CD8+值呈升高趨勢,機體內CD3+/CD4-/CD8-細胞數量顯著降低,表明BioA 可刺激機體淋巴細胞的分化。

本試驗結果發現,適當濃度的BioA 能促進機體Th1 和Th2 型細胞活化增殖,提高機體內IgG1 和IgG2 抗體水平,能促進OVA 誘導的細胞免疫和體液免疫反應。綜上,本試驗表明,BioA 具有免疫佐劑效果。