2 株山羊溶血性曼氏桿菌鑒定與分型

曾紫雄,高 尚,鞠輝明,張信軍,成大榮,楊躍飛,王彥紅

(1.揚州大學獸醫學院,江蘇 揚州225009;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心,江蘇 揚州 225009)

溶血性曼氏桿菌(Mannheimia haemolytica)原名溶血性巴氏桿菌(Pasteurella haemolytica),常存在于牛羊的鼻咽部,可致牛和綿羊肺炎、新生羔羊敗血癥、羊乳腺炎等疾病,在全球都有分布,對牛、羊養殖業危害大[1-2]。其主要的毒力因子有白細胞毒素,此外菌毛、莢膜多糖、唾液酸糖蛋白酶、外膜蛋白和脂多糖也參與致病作用[2]。在溶血性曼氏桿菌12個已確定的莢膜血清型(1、2、5、6、7、8、9、12、13、14、16和17 型)中,1 型、2 型和6 型是全世界最普遍的[3-5]。本研究從江蘇兩地養殖場的山羊肺炎病例中先后分離出2 株溶血性曼氏桿菌,對分離菌的血清型進行鑒定,同時采用多位點序列分型法獲取2 株細菌的ST 型,以分析該菌在本地區流行特點。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2017 年7 月南通海安一養殖戶飼喂的300 只山羊,日齡105 d,發病30 只,死亡20只,送檢2 只。對送檢的2 只病羊剖檢,1 只肺尖葉、心葉完全實變,肝土黃色、膽囊充盈,腿有1 個直徑2～3 cm 化膿灶;另1 只肺瘀血,表面有較多滲出物。取病羊的肝臟、肺臟的病變組織進行細菌的分離鑒定。2018 年2 月揚州儀征一養殖戶的本地山羊和波爾山羊雜交種,8～10 個月齡,死亡10 多只,送檢1 只,已病15 d,期間用氟苯尼考注射用藥,口腔潰瘍,口服用藥較多。病理剖檢肺尖葉、心葉肉變,心包膜膠凍樣水腫,心肌蒼白。膽囊充盈,小腸充血,腸黏膜出血,有少量白色結節。球蟲檢查為陽性。

1.2 細菌分離 無菌操作取病羊的肝臟、肺臟的病變組織接種于血瓊脂平板上,于溫箱中37 ℃培養24 h 后挑取血瓊脂平板上的單個菌落,分別接種于血瓊脂平板和麥康凱平板上,37 ℃溫箱培養24 h,觀察生長情況。挑取單個菌落,涂布,革蘭染色鏡檢。

1.3 生化試驗 采用細菌微量生化反應管(購自杭州天和微生物試劑有限公司),對所分離的菌株進行生化指標測定,最后放置于37 ℃溫箱中培養。培養時間及判定標準嚴格參照產品使用說明書。

1.4 16S rDNA 序列鑒定 采用煮沸裂解法制備分離株的細菌基因組DNA 模板,按照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 方法(寶生物工程(大連)有限公司)操作,PCR 擴增,經1%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,預期條帶長度約為500 bp。PCR 陽性產物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。將測定的序列在NCBI 網站(http：//www.ncbi.nlm.gov/BLAST)進行BLAST 搜索比對,鑒定細菌種屬。

1.5 PCR 鑒定血清型 根據Cassidy L K 等人[6]的研究方法采用PCR 方法依次區分鑒定2 株分離菌的血清型1 型、2 型和6 型,溶血性曼氏桿菌血清型1 型、2 型和6 型對應的目的基因、引物以及引物擴增長度如表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 擴增反應總體積為25 μL,包括0.2 μLTaq酶、2.5 μL 10×Buffer、0.5 μL dDTP、2 μL DNA 模板、0.2 μL 的上下游引物以及19.4 μL 超純水。PCR 循環條件為96 ℃預變性5 min,96 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30 個循環,末輪循環結束,72 ℃延伸10 min。經1%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳鑒定分離菌的血清型。

表1 PCR 鑒定血清型擴增的目的基因、所需引物以及引物擴增長度

1.6 MLST 根據MLST 網站中的溶血性曼氏桿菌信息庫(http：//pubmlst.org/mhaemolytica/)獲取7個管家基因和MLST 分析中的PCR 信息、引物信息以及擴增序列的長度(表2)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 擴增反應總體積為25 μL,包括0.2 μLTaq酶、2.5 μL10×Buffer、0.5 μL d DTP、2 μL DNA 模板、0.2 μL 的上下游引物以及19.4 μL 超純水。PCR 擴增反應循環條件為96 ℃預變性5 min,96 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30 個循環,末輪循環結束后72 ℃延伸10 min。PCR 擴增產物經1%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 陽性產物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序,將2 株分離菌的7 個管家基因測序結果上傳至數據庫(http：//pubmlst.org/mhaemolytica/)搜索比對。

表2 管家基因、引物序列及擴增引物長度

1.7 藥敏試驗 通過紙片擴散試驗檢測細菌對抗菌藥物的敏感性,將各種抗菌藥物圓紙片分別貼于培養基表面。37 ℃培養24 h 觀察結果?？咕幬锛埰?購自杭州天和微生物試劑有限公司),所含藥物分別有慶大霉素、左氧氟沙星、鏈霉素、卡那霉素、多黏菌素B、氟苯尼考、新霉素、諾氟沙星、多西環素、美洛西林、妥布霉素、丁胺卡那霉素、環丙沙星、阿莫西林、頭孢哌酮、頭孢噻肟,含量及敏感性判定標準如表3。

2 結果

2.1 細菌分離 對剖檢病料分離細菌并純化得到2 株細菌,分別命名為MH1、MH2。2 株分離菌在血瓊脂平板上生長良好,并有明顯的溶血現象,在麥康凱培養基上不生長。革蘭染色鏡檢發現2 株分離菌均為革蘭陰性短桿菌,兩端鈍圓,單個或散在排列。

2.2 生化試驗 2 株分離菌均能發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖等糖類,發酵甘露醇,不發酵甘露糖,氧化酶陽性,尿酶陰性,此生化結果符合溶血性曼氏桿菌的生化反應特點。

2.3 16S rDNA 基因序列鑒定 將測定的序列上傳至NCBI 網站進行BLAST 搜索比對,結果表明,所獲得的序列與已公布的溶血性曼氏桿菌16S rRNA 基因部分序列(AF060699.1)的同源性為99%。

2.4 血清型和MLST 2 株分離菌經血清型鑒定PCR 后,電泳出現約160 bp 條帶,故為血清型2 型。將2 株分離菌的7 個管家基因測序結果上傳至數據庫(http：//pubmlst.org/mhaemolytica/)搜索比對,得到的結果是2 株細菌的7 個管家基因的等位基因adk、aroE、deoD、gapDH、gnd、mdh和zwf的序號分別為1、1、3、1、1、1 和4,序列型一致,均是ST46。

圖1 PCR 血清型鑒定結果

圖2 7 個管家基因PCR 檢測結果

2.5 藥敏試驗 2 株細菌藥敏試驗結果見表3。MH1 對鏈霉素耐藥,對多西環素和妥布霉素中介,對其他13 種藥物均敏感;MH2 對鏈霉素中介,對其他15 種藥物均敏感。

3 討論

根據送檢羊剖檢癥狀、細菌分離培養特點、鏡檢結果、生化特征及16S rDNA 序列鑒定結果,表明從送檢羊中分離出的2 株細菌為溶血性曼氏桿菌。溶血性曼氏桿菌是導致羊的鼻咽部等呼吸道疾病的常見菌,可引起羊肺炎、新生羔羊敗血癥、羊乳腺炎等疾病,在全球都有分布,對羊養殖業危害大[1-2]。根據文獻報道,羊源溶血性曼氏桿菌莢膜血清型多為2 型[4-5],本次分離菌的血型也為2 型,與研究報道一致。

多位點序列分型法(multilocus sequence typing,MLST)是通過測序技術來揭示管家基因中的等位基因的變異情況,從而對病原微生物分型和鑒定的方法[7]。在MLST 方法中,對某一菌株每個管家基因的所有等位基因都按發現的先后順序分配一個等位基因序號(allele number),把該菌株所有管家基因的每個等位基因合并在一起組成一個等位基因譜(allelic profile),并給這個等位基因譜分配一個唯一的編號作為該分離株的核酸型或序列型(Sequence type,ST)[7]。由于管家基因幾乎都存在一定的保守性,而不同的菌株間又存在一定的差異,這些差異可以使得細菌的生長發育和新陳代謝產生不同,故通過MLST 對管家基因的分析可以準確記錄細菌基因水平上的變異[8-9]。它還可以通過互聯網識別和追蹤病原菌,使分型的數據在全球各實驗室之間得以交換,為分子流行病學的研究提供了一種新的方法[10]。在此次研究中,2 株分離菌ST 均為46,此基因型是一個新的ST 型,目前在江蘇地區分離出此基因型,補充了溶血性曼氏桿菌的數據庫,并為進一步的細菌分子流行病學研究奠定了基礎。

目前使用抗生素仍是治療感染溶血性曼氏桿菌病例的主要手段,故細菌的耐藥性在臨床上需要重點關注。此前,黃宇[11]等人對廣西的1 株溶血性曼氏桿菌進行耐藥性分析,結果顯示,細菌對復方新諾明、多粘菌素B、卡那霉素、青霉素G 和氨芐西林表現為耐藥;李娟[1]等人對江蘇的1 株溶血性曼氏桿菌進行耐藥性分析,結果顯示,對四環素、鏈霉素、磺胺嘧啶、大環內脂類和磺胺二甲基嘧啶等存在耐藥性。本次研究中也出現了1 株細菌對鏈霉素耐藥的情況。因此,建議避免盲目濫用、長期使用同種抗菌藥物,結合分離鑒定到的病原的藥敏試驗結果有針對性的用藥。除此之外,加強畜舍的衛生通風管理,減少應激不失為良好的輔助預防和治療溶血性曼氏桿菌病的措施。

表3 2 株溶血性曼氏桿菌藥敏試驗結果